[發明專利]狼瘡抗凝物篩選測定試劑盒（凝固法）

有效

• 申請號: 201210189460.4
• 申請日: 2012-06-08
• 公開（公告）號: CN102692516A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 謝永華
• 申請（專利權）人: 上海太陽生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/86
• 分類號: G01N33/86
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;李玉秋

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，特別涉及一種稀釋蝰蛇毒試驗法篩選測定血漿中狼瘡抗凝物的試劑。

背景技術

狼瘡抗凝物（Lupus?anticoagulant，LA）是一種磷脂依賴性的病理性循環抗凝物質，在體外有抗凝血作用，而在體內能與磷脂作用產生促凝效果，促進血栓形成。現已發現它可存在于多種疾病中，該物質的持續存在被認為是不明原因的習慣性流產、死胎、胎兒發育遲滯、動靜脈栓塞、各種易栓性疾病以及某些自身免疫性疾病的危險信號。因此，LA的篩選檢測對臨床各科疾病診斷具有重大意義。

近年來已發展了多種LA篩選方法，其中，應用最廣的是凝固法。根據凝血途徑的不同，凝固法篩選LA有三種途徑：外源途徑、內源途徑和共用途徑。

1.內源途徑的LA篩選法：APTT、KCT和CSCT

APTT是常用的LA初篩實驗，其靈敏度取決于試劑中磷脂的種類和濃度。不同廠家制備的APTT試劑因磷脂成分和濃度不同而導致實驗的敏感性差異較大，如含磷脂酰絲氨酸量多的試劑會減低LA的檢出率。

KCT試劑因含磷脂量較低而敏感性高，但白陶土試劑不能用于光學法的檢測且易形成沉淀，此實驗對凝血試驗時間長的標本重復性差。

CSCT是在KCT試劑基礎上改變了激活劑，將白陶土激活劑改為了澄清度高沉降度低的膠體。

APTT、KCT和CSCT檢測都要求樣品中的凝血因子含量正常，不能檢測凝血因子缺乏的血漿是否含有LA。

2.外源途徑的LA篩選方法：PT

當試劑中的磷脂濃度成為凝固限制速率因子時，PT法能較靈敏的檢測LA的存在，磷脂的種類成為該試劑檢測LA的關鍵；但是PT因為試劑中的促凝血酶原激酶的易變性而不是很適合檢測LA。

3.共用途徑的LA篩選方法：Textarin、Ecarin和dRVVT

基于蛇毒如Ecarin和Textarin的檢測試劑，其激活劑來源是各種蛇毒中的促凝血酶。這些試劑中的激活劑不受內外源途徑中凝血因子的影響，專一性強，可以用來檢測抗磷脂抗體，如LA。但是Ecarin和Textarin檢測方法還沒有商業化的檢測準則，不適合用于臨床檢測。

稀釋蝰蛇毒實驗法（dRVVT）以蝰蛇毒FⅩ激活劑與稀釋的磷脂一起用于檢測，“跳過”了內外源途徑直接作用于凝血Ⅹ因子，具有很強的專一性和靈敏度。該檢測方法經國際體外質量評估流程實驗室證明，是最有力的LA檢測方法。

dRVVT篩選試劑的關鍵在于其特異性和靈敏度，而磷脂的種類及濃度決定了dRVVT篩選試劑的特異性和靈敏度。現有技術選用的磷脂種類多采用動物腦磷脂，如牛腦磷脂、兔腦磷脂，往往會因其靈敏度不高降低狼瘡抗凝物的檢出率。

發明內容

針對上述現有技術的缺陷，本發明要解決的技術問題為提供一種靈敏度較高、特異性較好的稀釋蝰蛇毒實驗法篩選測定狼瘡抗凝物的試劑。

為解決上述技術問題，本發明提供了一種狼瘡抗凝物的篩選測定試劑，該試劑包括蝰蛇毒凝血因子X激活劑、菜籽磷脂、鈣離子。

所述蝰蛇毒凝血因子X激活劑來自圓斑蝰蛇蛇毒，可以采用本領域的常規技術手段從圓斑蝰蛇蛇毒中提取獲得，也可以從商業途徑獲得；該激活劑在篩選測定狼瘡抗凝物時的工作濃度為2～5U/ml，優選工作濃度為3U/ml。

上述濃度單位中U的定義，1U為1ml所述凝血因子X激活劑溶液在37℃條件下與1ml正常人體質控血漿混合后加入1ml?0.025mol/L的氯化鈣溶液能在50-70s內發生凝結的量。

所述菜籽磷脂，是從油菜籽中提取得到的一種混合物，主要成分為腦磷脂、絲氨酸磷脂和肌醇磷脂等，該菜籽磷脂可以由商業途徑獲得。所述菜籽磷脂在篩選測定狼瘡抗凝物時的工作濃度為5～20μg/ml，優選工作濃度為10μg/ml。

所述鈣離子的供體為氯化鈣，所述氯化鈣的工作濃度為12.5mM。

上述篩選測定試劑還包括緩沖液、肝素中和劑，選擇性地包括穩定劑和防腐劑。

所述緩沖液為Tris-HCl緩沖液、咪唑緩沖液、磷酸或磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、巴比妥緩沖液、硼酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液或MOPS緩沖液中的任意一種，優選濃度為50mM、pH值為7.3的咪唑緩沖液。

所述肝素中和劑為魚精蛋白、多聚L-賴氨酸、凝聚胺或多聚L-精氨酸中的任意一種。

作為優選，所述肝素中和劑為凝聚胺，所述凝聚胺在篩選測定狼瘡抗凝物時的工作濃度為1～10μg/ml，優選工作濃度為3μg/ml。