[發(fā)明專利]一種牡蠣近緣物種鑒定的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210189381.3
• 申請日: 2012-06-08
• 公開（公告）號: CN102758009A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王家豐;許飛;李莉;張國范
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及近緣種鑒定技術(shù)，具體的說是一種牡蠣近緣物種鑒定的方法。

背景技術(shù)

牡蠣屬軟體動物門中的瓣鰓綱(或雙殼綱)。牡蠣具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是世界各國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖對象，已成為中國乃至世界水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)動物。尤其是牡蠣全基因組測序的完成，標(biāo)志著牡蠣進(jìn)入了基因組時代，牡蠣的分子生物學(xué)研究，功能基因?qū)W研究，組學(xué)研究等相關(guān)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用性研究相繼展開。物種的區(qū)分和鑒定是各種研究工作的基礎(chǔ)，然而牡蠣物種種類十分復(fù)雜，外形極易受到環(huán)境的影響；關(guān)于其分類也存在諸多的爭議和分歧，分類依據(jù)也不盡相同。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子生物學(xué)手段來鑒定物種已經(jīng)逐漸成為一種趨勢，并為大多數(shù)的生物學(xué)家所接受。目前最常見的是應(yīng)用線粒體COI基因及ITS序列差異作為區(qū)分不同物種的分類依據(jù)，但是這些基因序列之間的區(qū)別往往是SNP或者是In/de?l，不同物種之間序列長度的變化并不明顯，因此難以應(yīng)用電泳等方法區(qū)別不同物種；測序可以取得這個基因或者序列的詳細(xì)堿基信息，但是測序?qū)嶒?yàn)過程比較繁瑣，花費(fèi)也較高，并且需要大型儀器的支持，很難在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、簡單的物種鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種牡蠣近緣物種鑒定的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種牡蠣近緣物種鑒定的方法，以牡蠣基因組DNA為模板，根據(jù)牡蠣各物種基因組的標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率熔解曲線(High?Resolution?Melting，HRM)中的Tm值差異進(jìn)而區(qū)分牡蠣物種。

通過上述擴(kuò)增獲得40bp-100bp的PCR產(chǎn)物，添加核酸飽和染料后95℃變性處理10分鐘，冷卻至室溫進(jìn)行HRM測定。

以待鑒定牡蠣基因組DNA為模板，根據(jù)牡蠣的COI基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率熔解曲線(HRM)中的Tm值差異進(jìn)而區(qū)分貝類相近物種；序列擴(kuò)增引物為：

COI-F1：TACTTAATATTGGGTTTTTAGGGT；

COI-R1：CGCGTATCAATATCCATTCC。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：

1.方法簡單易行；不需要測序，直接通過擴(kuò)增片段的Tm值來反應(yīng)DNA水平上的區(qū)別而區(qū)分不同物種。

2.結(jié)果明確直觀；不用進(jìn)行序列比對等步驟，不同物種之間DNA水平的差異以直觀的峰圖形式表現(xiàn)出來，極易區(qū)分辨別。

3.準(zhǔn)確有效；本發(fā)明鑒定方法采用高分辨率熔解曲線(HRM)具有分辨單個核苷酸差異的能力，能夠準(zhǔn)確反映DNA水平上的差異，使得鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，與測序結(jié)果相比較準(zhǔn)確率為100％。

4.應(yīng)用性廣泛；與測序不同，不需要將待鑒定的所有個體一一測序分析。本發(fā)明中一組引物可以在無限多同類個體上進(jìn)行物種鑒定而不需要重新設(shè)計(jì)引物。其次，本發(fā)明為一個開放體系，應(yīng)用范圍廣泛；不僅可用于特定幾種牡蠣近緣物種的鑒定，只要是基于DNA水平上的差異能夠區(qū)分的牡蠣物種均可以利用該方法來鑒定。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的巨蠣屬牡蠣近緣物種鑒定高分辨率熔解曲線圖(其中橫坐標(biāo)為溫度(℃)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度的對數(shù)值；每條曲線的最高點(diǎn)所對應(yīng)的橫坐標(biāo)即為該曲線對應(yīng)的PCR產(chǎn)物的Tm值)。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的巨蠣屬牡蠣近緣物種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明在依靠核酸序列區(qū)別而進(jìn)行物種鑒定的過程中引入高分辨率熔解曲線方法，僅用一對PCR引物將不同物種在DNA水平上的差異轉(zhuǎn)化成更直觀的熔解曲線。其步驟為：

a.物種鑒定依據(jù)序列的獲得：從已有數(shù)據(jù)庫或其它來源獲得能夠區(qū)分目標(biāo)物種的依據(jù)序列(如COI基因序列等生物標(biāo)簽序列)。

b.引物設(shè)計(jì)：比對不同物種之間依據(jù)序列的差異，尋找能夠明顯區(qū)分目標(biāo)物種的區(qū)域，利用primer?premier5軟件在該區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物在不同物種間應(yīng)有明顯序列差異(即Tm值不同)，主要體現(xiàn)為G、C含量不同。

c.PCR擴(kuò)增：以待鑒定目標(biāo)貝類的基因組DNA為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

d.產(chǎn)物檢測及處理：利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，確定擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無非特異性擴(kuò)增后，每個反應(yīng)添加1μl核酸飽和染料LC-green(Idaho，美國)，在普通PCR儀上運(yùn)行95℃變性10min后冷卻至室溫。