[發明專利]一種快速鑒定啤酒酵母單倍體的方法

無效

• 申請號: 201210189030.2
• 申請日: 2012-06-11
• 公開（公告）號: CN102732620A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 李崎;許維娜;王金晶;李永仙;劉春鳳;鄭飛云
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種鑒定啤酒酵母單倍體的方法，特別是一種基于菌落PCR和流式細胞技術的方法，屬于微生物鑒定領域。

背景技術

酵母是啤酒釀造的靈魂，對啤酒質量起至關重要的作用。工業啤酒酵母包括上面酵母(ale?brewing?yeast，Saccharomyces?cerevisiae)和下面酵母(lager?brewing?yeast，Saccharomyces?pastorianus)兩大類，市售啤酒90％以上是由下面酵母發酵而成，所以對工業啤酒酵母的研究也大多是針對下面酵母的。

下面酵母又稱卡爾酵母，為異源雜合的多倍體或非整倍體，他們復雜的倍性給酵母改良和遺傳研究帶來了諸多困難。酵母單倍體菌株只有一套染色體，基因情況簡單明了，常被用作遺傳學和育種工作的模式菌株，既為性狀遺傳分析所必需，又可為雜交作好親本的準備。而且，單倍體菌株具有細胞小、蛋白酶A產量低、自溶性能好等優勢，在理論研究和實際應用中都具有深遠意義。但因為工業啤酒酵母長期生活在營養充足的環境里，產孢能力退化，單倍體分離率和成活率低，而且缺乏行之有效的鑒定方法，因此此方面的研究并不多。

發明內容

本發明要解決的技術問題是建立一種能精確、高效鑒定啤酒酵母倍性的方法。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案為：首先采用菌落PCR進行初步判定，然后通過流式細胞儀檢測DNA含量確定倍性；菌落PCR的特異性引物為：

MAT特異性引物(5′-AGTCACATCAAGATC?GTTTATGG-3′)；

MATa特異性引物(5′-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3′)；

MATα特異性引物(5′-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3′)。

本發明的具體檢測步驟如下：

(1)待檢測的菌種稀釋涂布YEPD平板，28℃培養2-3天后，用牙簽小心挑取適量菌體到1.5mL離心管，為避免瓊脂干擾PCR結果，可先將細胞洗滌2-3次，收集菌體后進行菌落PCR。

(2)PCR反應中所用三種引物分別為：MAT特異性引物(5′-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3′)；MATa特異性引物(5′-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3′)；MATα特異性引物(5′-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3′)。PCR反應體系中(100μL)加入適量細胞、三種引物各2μL、dNTP?8μL、10×buffer?10μL、rTaq酶0.5μL、ddH₂O?75.5μL，適當混勻后置于TECHNE?TC-5000PCR儀進行PCR反應，條件為95℃變性5min；94℃變性1-2min，50℃退火30-60s，72℃延伸1-2min，25-40個循環；72℃總延伸5min。。

(3)PCR產物進行1.2％-2％的瓊脂糖電泳。單倍體菌株的電泳結果只有一條條帶，其中MATa型的為544bp，MATα型的為404bp，雜合二倍體和多倍體菌株同時有兩條條帶，純合二倍體和多倍體菌株只有相應的一條條帶。

(4)選取電泳結果只有一條條帶的菌種(單倍體或純和多倍體、雜倍體)進行流式細胞分析。

(5)將選出的菌株與單倍體標準菌分別接種于YEPD液體培養基，28℃振蕩培養12-24h。取0.5-1mL菌液到1.5mL離心管中，8,000×g-12,000×g離心5-10min收集菌體，菌體重懸于PBS緩沖液后離心、洗滌2-3次，然后用PBS溶解。

(6)將菌液沸水浴2-8min殺死細胞。加入10-12μL?10mg/mL的RNaseA，50℃水浴30-50min，然后加入20-24μL?20mg/mL?proteinase?K，50℃水浴30-50min。離心后收集菌體，重懸于PBS后適當稀釋，超聲10-20s，間隔2-3s，重復2-3次。

(7)上機前每mL樣品加入5-10μL?1mg/mL的碘化丙錠(PI)，避光反應5-10min。

(8)樣品倍性用Becton?Dickinson?FACSCalibur流式細胞儀進行分析。超純水作為流動鞘液，用氬離子激發熒光，激發波長為488nm，使用660/16nm帶濾光片作PI熒光分析，每個樣品至少檢測1×10⁴個細胞，得到FCM圖譜。