[發明專利]一株產α-酮戊二酸的菌株及用其發酵生產α-酮戊二酸的方法

有效

• 申請號: 201210189014.3
• 申請日: 2012-06-08
• 公開（公告）號: CN102676438A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 王正祥;田康明;周麗;沈微
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P7/50;C12R1/19
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明采用微生物發酵法生產α-酮戊二酸。發明內容涉及一株基因改造后丙酮酸代謝過程可動態調控的α-酮戊二酸高產菌株，以及相關的發酵生產技術。本發明是一種高光學純度和化學純度的α-酮戊二酸制造技術，發酵生產過程中只有痕量琥珀酸，乙酸等雜酸的生成。屬于微生物發酵工程技術領域。

背景技術

α-酮戊二酸(α-ketoglutaric?acid，α-KG)，又名α-氧代戊二酸，α-膠酮酸，α-羰基戊二酸，α-酮基戊二酸，在細胞代謝中起重要作用，是三羧酸循環的重要中間產物之一，在生物體內參與氨基酸、蛋白質和維生素的合成以及能量代謝。α-酮戊二酸在醫藥工業、飼料工業、有機合成和功能性食品等領域應用廣泛。醫藥工業方面，α-酮戊二酸主要作為生化試劑和測肝功能的配套試劑，另外α-酮戊二酸還具有抗氰作用，可以起到抗驚厥作用；飼料工業方面，作為飼料添加劑可以提高動物抗應激能力，增強免疫功能，促進骨骼發育和提高繁殖率；有機合成方面，α-酮戊二酸也是重要的化工合成中間體，用于多種衍生化學品的合成；功能性食品方面，α-酮戊二酸主要作為運動營養飲料的成分，同時可以降低術后患者和長期病人的機體損耗。

目前α-酮戊二酸的合成主要采用化學合成法。與化學合成法相比較，微生物發酵法用于α-酮戊二酸的合成在產品制備過程和產品品質方面均優勢明顯。因此隨著優良生產菌種的選育和發酵技術的不斷成熟，微生物發酵法必將會取代化學合成法成為α-酮戊二酸的主要合成方式。多種微生物被報道可以用于α-酮戊二酸的發酵生產，包括解脂假絲酵母(Candida?lipolytica)、解脂亞洛酵母(Yarrowia?lipolytica)、光滑球擬酵母(Torulopsis?glabrata)以及谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium?glutamicum)等細菌。而大腸桿菌用于α-酮戊二酸的發酵生產未見報道。

大腸桿菌作為遺傳背景最為清晰的微生物之一，被廣泛的用于包括人類在內的生命體代謝相關機理的研究。隨著大腸桿菌代謝網絡和分子水平上調控機理的不斷被揭示和闡明，單一代謝中間體在大腸桿菌中的積累研究成果豐碩。目前，乙醇，乙酸，丙酮酸，琥珀酸，蘋果酸，乳酸等多個代謝中間物的大量合成均可以在大腸桿菌中實現。一分子葡萄糖通過EMP途徑形成兩分子丙酮酸的過程中會形成兩分子NADH，兩分子丙酮酸形成乙酰輔酶A的過程則會再產生兩分子NADH。乙酰輔酶A進入TCA循環后會形成更多NADH用于產生能量合理高能化合物ATP等。

大腸桿菌中，丙酮酸主要有四個流向。一是磷酸烯醇式丙酮酸合酶（pps）作用下回流形成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）。二是經丙酮酸氧化酶（pox）作用下直接形成乙酸。三是經乳酸脫氫酶（ldhA）作用還原形成乳酸。四是形成乙酰-CoA。丙酮酸形成乙酰-CoA存在兩條途徑，一條途徑是，丙酮酸在甲酸裂解酶（pfl）的作用下形成甲酸和乙酰-CoA，該途徑主要在氧氣不足時發揮作用。另一條途徑是，氧氣存在條件下，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶復合體（pdh）的作用下脫羧氧化形成乙酰-CoA。因此，失活磷酸烯醇式丙酮酸合酶（pps）、丙酮酸氧化酶（pox）、甲酸裂解酶（pfl）和乳酸脫氫酶（ldhA）后，丙酮酸主要在丙酮酸脫氫酶復合體（pdh）作用下流向乙酰-CoA，進而進入TCA循環。在此基礎上阻斷α-酮戊二酸的分解代謝途徑，獲得的菌株即為α-酮戊二酸發酵生產菌株。由于α-酮戊二酸的下行代謝途徑主要由α-酮戊二酸脫氫酶復合體催化完成。因此可以通過失活脫氫酶復合體實現上述設想。然而α-酮戊二酸脫氫酶復合體和丙酮酸脫氫酶復合體同屬于α-酮酸脫氫酶復合體，其催化單元屬于同一個催化酶系。因此，α-酮酸脫氫酶復合體主要酶系（如E1，E2和E3）的輔因子同時參與α-酮戊二酸脫氫酶復合體和丙酮酸脫氫酶復合體。有益的是，這些輔因子會優先作用于丙酮酸的脫氫酶復合體形成乙酰-CoA，因此控制細胞中該酶系輔因子的水平可以有效的實現丙酮酸形成乙酰-CoA途徑順暢的同時使得α-酮戊二酸下行分解代謝受阻，進而實現α-酮戊二酸的過量積累。本發明正是基于這一策略成功構建了高效合成α-酮戊二酸的重組大腸桿菌，并建立了對應的簡潔發酵工藝。