[發明專利]鼠源性單克隆抗體3D8識別的漢灘病毒糖蛋白中和表位肽及應用

有效

• 申請號: 201210188902.3
• 申請日: 2012-06-08
• 公開（公告）號: CN102731623A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 張宇絲;徐志凱;閆果林;莊然;吳興安;張芳琳;張赟;徐竹蔚;易靜;張春梅;馬櫻;劉蓓;陳麗華;楊琨;宋朝君;李琦;方亮;周幸春;劉志佳;金伯泉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;G01N33/68;A61K39/12;A61P31/14;A61P13/12
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

1.一種鼠源性單克隆抗體3D8識別的漢灘病毒糖蛋白中和表位肽，其特征在于，其氨基酸序列為⁸⁸²GFLCPEFPGSFRKKC⁸⁹⁶。

2.如權利要求1所述的鼠源性單克隆抗體3D8識別的漢灘病毒糖蛋白中和表位肽，其特征在于，其中，氨基酸序列中的⁸⁸⁵C，⁸⁹³R，⁸⁹⁴K，⁸⁹⁵K和⁸⁹⁶C為其關鍵氨基酸殘基序列。

3.權利要求1所述的鼠源性單克隆抗體3D8識別的漢灘病毒糖蛋白中和表位肽的檢測方法，其特征在于，首先合成281條重疊多肽，每條合成肽長度為15個氨基酸，相鄰肽重疊11個氨基酸，通過間接ELISA法和Dotblot法進行肽掃描，檢測合成肽對3D8單抗的反應性，最終將該表位肽精確定位為：⁸⁸²GFLCPEFPGSFRKKC⁸⁹⁶，其中，⁸⁸⁵C，⁸⁹³R，⁸⁹⁴K，⁸⁹⁵K和⁸⁹⁶C為其關鍵氨基酸殘基。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的間接ELISA法，包括如下步驟：

孔ELISA板上包被合成肽，包被濃度10μM，包被量為1nmol，包被條件為4℃72小時以上，封閉前在37℃繼續包被2小時；

用PBS-T洗滌2次后，每孔加入300μL含5%FCS的抗體稀釋液PBS-T，37℃封閉2小時；

用上述抗體稀釋液1∶2500稀釋3D8單抗，每孔加入100μL，37℃反應1.5小時；

用PBS-T洗滌3次后，加入二抗，用上述抗體稀釋液1∶2500稀釋HRP標記的羊抗小鼠IgG至1∶2500，每孔加入100μL，37℃反應1小時；

PBS-T洗滌3次后顯色，每孔加入100μLTMB，反應45~60分鐘，每孔加入50μL?2M?H₂SO₄終止反應；

用酶標儀在450nm處測定OD值。

5.如權利要求3所述方法，其特征在于，所述的Dot?blot法包括如下步驟：

在NC膜上標記點樣位置；

按順序滴加待測肽1nM于各點樣位置，待其自然干燥；

將點樣后的NC膜浸入含10%FCS的抗體稀釋液TBS-T中，室溫封閉1小時~2小時；

封閉后的NC膜與3D8單抗（用上述的抗體稀釋液1∶4000稀釋）4℃過夜反應；

用TBS-T洗滌NC膜5次，每次10分鐘；

NC膜孵育二抗，用上述抗體稀釋液1∶2500稀釋HRP標記的羊抗小鼠IgG，室溫避光反應1小時；

TBS-T洗滌NC膜5次，每次10分鐘，ECL成像。

6.權利要求1所述的鼠源性單克隆抗體3D8識別的漢灘病毒糖蛋白中和表位肽用于制備漢灘病毒多肽疫苗的應用，或用于制備治療腎綜合征出血熱的藥物的應用。

7.權利要求1所述的鼠源性單克隆抗體3D8識別的漢灘病毒糖蛋白中和表位肽用于研究3D8中和單克隆抗體治療腎綜合征出血熱的機制，或作為靶蛋白用于開發漢灘病毒76-118株相關診斷試劑盒。