[發明專利]鲇生長激素與穿腸膜肽TAT融合蛋白及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210188435.4
• 申請日: 2012-06-08
• 公開（公告）號: CN102899342A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 孟小林;徐進平;王健;于京佑
• 申請（專利權）人: 武漢凱肽來生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;C12N1/21;C12N15/70;A23K1/165;C12R1/19
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏峰

1.一種分離重組的基因，其特征在于：其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種分離重組的融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2所示。

3.一種表達權利要求2所述蛋白的大腸桿菌基因工程菌株，其特征在于：大腸桿菌（Escherichia?coli）BL21（DE3）pET-22b(+)-saGH-TAT，F^-ompT?hsdS_B(r_B^-m_B^-)gal?dcm(DE3)；?CCTCC?NO：M2012126。

4.權利要求2所述融合蛋白的制備方法，其步驟是：

A.?鲇生長激素基因的制備：獲取鲇頭部腦垂體，根據GeneBank中已經發表的鲇科魚類GH的序列設計PCR兼并引物，以上述腦垂體提取的RNA作為模板反轉出cDNA，PCR擴增目的基因saGH，PCR產物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產物并將其克隆到pMD18-T載體中，挑取單菌落用堿裂解法小量提取質粒進行酶切鑒定，并進行測序，得到的陽性克隆子即為包含saGH基因的大腸桿菌，用于基因的擴增和保藏；

B.通過重疊延伸PCR的方法將TAT?33bp?堿基連入saGH?的3'端構成saGH-TAT，將PCR產物組裝入pMD18-T?載體，轉化大腸桿菌JM109，挑取單菌落用堿裂解法小量提取質粒進行酶切鑒定，并進行測序,得到的陽性克隆子即為包含saGH-TAT的大腸桿菌，用于基因的擴增和保藏；

C.?融合基因的制備及表達載體的構建：首先雙酶切重組質粒pMD18-T-saGH-TAT和質粒pET-22b（+）,?膠回收含saGH-TAT基因的片段和開環pET-22a（+）片段，16℃連接后轉化到感受態E.coli中，所得到的陽性克隆子是包含saGH-TAT融合基因的大腸桿菌；

D.基因工程菌的制備：將步驟C中制得的質粒pET-22a（+）-saGH-TAT轉化到感受態BL21（DE3）中，PCR鑒定篩選出陽性轉化子，所得陽性克隆即為本發明涉及的能夠表達saGH-TAT的大腸桿菌基因工程菌株；

E.基因工程融合蛋白的制備：將上述基因工程菌轉接到2×YT培養基中，融合蛋白saGH-TAT以包涵體的形式高效表達。

5.權利要求2所述融合蛋白在促進硬骨魚體生長中的應用。

6.權利要求2所述的融合蛋白在增強羅非魚耐高滲透壓海水中的應用。