[發明專利]特定肉制品的LAMP法檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201210187031.3
• 申請日: 2012-06-08
• 公開（公告）號: CN102899394A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 唐善虎;李雪;郝小倩
• 申請（專利權）人: 西南民族大學;唐善虎
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙) 51220
• 代理人: 梁田

1.特定肉制品的LAMP法檢測試劑盒，包括五組相互獨立的A型反應液，該五組相互獨立的A型反應液是檢測牦牛肉的反應液A-1、檢測雞肉的反應液A-2、檢測豬肉的反應液A-3、檢測兔肉的反應液A-4或檢測羊肉的反應液A-5，還包括能與該五組相互獨立A型反應液分別反應的反應液B；各反應液的成分和配合比如下：

（1）檢測牦牛肉的反應液A-1：每管23.000?μl的組成及配合比如下，

2.500?μl?的10×Lamp?buffer、

1.000?μl?的Bst??DNA聚合酶8U/μl、

3.500?μl?的10mM?dNTP、?

1.000?μl的20μM牦牛肉的內引物1：

GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATT-TTTT-TAAAGACTAGACCTACAAGTCA、

1.000?μl的20μM牦牛肉的內引物2：

TAGGGATAACAGCGCAATCCT-TTTT-ATGTCCTGATCCAACATCG、

0.125?μl的20μM牦牛肉的外引物1：AAAAAATCCTCCGAACGATT、

0.125?μl的20μM牦牛肉的內引物2：GATAGCGGTTGCACCATC、

0.500?μl的20μM牦牛肉的環引物1：GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、

0.500?μl的20μM牦牛肉的環引物2：TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT、

4.000?μl?的25mM?MgCl_2?、

4.000?μl?的5M甜菜堿、

余量為滅菌蒸餾水；

其中，10×Lamp?buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/?pH?8.8、?100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100；

（2）檢測雞肉的反應液A-2：每管23.000?μl的組成及配合比如下，

2.500?μl?的10×Lamp?buffer、

1.000?μl?的Bst??DNA聚合酶8U/μl、

3.500?μl?的10mM?dNTP、?

1.000?μl的20μM雞肉的內引物1：

TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGAT-TTTT-CCCACTATGCCTAGCCCTA、

1.000?μl的20μM雞肉的內引物2：

AACTCTAAGGACTTGGCGGTGC-TTTT-GGTGGTTGGGTGAATCGTG、

0.125?μl的20μM雞肉的外引物1：AAAGCTAGGACCCAAACTGG、

0.125?μl的20μM雞肉的內引物2：GGTATGTAGGCTGTGCTGG、

0.500?μl的20μM雞肉的環引物1：TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、

0.500?μl的20μM雞肉的環引物2：CCCAAACCCACCTAGAGGAG、

4.000?μl?的25mM?MgCl_2?、

4.000?μl?的5M甜菜堿、

余量為滅菌蒸餾水；

其中，10×Lamp?buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/?pH?8.8、?100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100；

（3）檢測豬肉的反應液A-3：每管23.000?μl的組成及配合比如下，

2.500?μl?的10×Lamp?buffer、

1.000?μl?的Bst??DNA聚合酶8U/μl、

3.500?μl?的10mM?dNTP、?

1.000?μl的20μM豬肉的內引物1：

CAGGCTCCTCTAGGTGGATG-TTTT-TCGCAACTGCCTAAAACTC、

1.000?μl的20μM豬肉的內引物2：

TCGATAAACCCCGATAGACCTT-TTTT-TAGGGTTTGCTGAAGATGG、

0.125?μl的20μM豬肉的外引物1：CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、

0.125?μl的20μM豬肉的內引物2：ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT、

0.500?μl的20μM豬肉的環引物1：AGCACCGCCAAGTCCTTT、

0.500?μl的20μM豬肉的環引物2：CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT、

4.000?μl?的25mM?MgCl_2?、

4.000?μl?的5M甜菜堿、

余量為滅菌蒸餾水；

其中，10×Lamp?buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/?pH?8.8、?100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100；

（4）檢測兔肉的反應液A-4：每管23.000?μl的組成及配合比如下，

2.500?μl?的10×Lamp?buffer、

1.000?μl?的Bst??DNA聚合酶8U/μl、

3.500?μl?的10mM?dNTP、?

1.000?μl的20μM兔肉的內引物1：

GGAAGGCTATGTCAGGAGCC-TTTT-TATAATTGGAGGCTTCGGGA、

1.000?μl的20μM兔肉的內引物2：

CATTCCTTCTTCTACTAGCCTCCT-TTTT-GGTGGATAAACAGTTCAGC、

0.125?μl的20μM兔肉的外引物1：ACATGCCTTTGTAATAATCTTCT、

0.125?μl的20μM兔肉的內引物2：GCATGTGCAAGATTACCG、

0.500?μl的20μM兔肉的環引物1：TGACCGAACAGGGGGACT、

0.500?μl的20μM兔肉的環引物2：AGTAGAAGCTGGGGCGGGGA、

4.000?μl?的25mM?MgCl_2?、

4.000?μl?的5M甜菜堿、

余量為滅菌蒸餾水；

其中，10×Lamp?buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/?pH?8.8、?100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100；

（5）檢測羊肉的反應液A-5：每管23.000?μl的組成及配合比如下，

2.500?μl?的10×Lamp?buffer、

1.000?μl?的Bst??DNA聚合酶8U/μl、

3.500?μl?的10mM?dNTP、?

1.000?μl的20μM羊肉的內引物1：

ATGTGGTTATAGCCCCTAGACATAA-TTTT-CCGGTTTTATCCACTAACAGAA、

1.000?μl的20μM羊肉的內引物2：

TATGCGCCCTCACCCAAAAT-TTTT-TTACTATTATGAGGCCGAGTT、

0.125?μl的20μM羊肉的外引物1：AGCAGGCATCTTCCTACT、

0.125?μl的20μM羊肉的內引物2：GGGGTTGATTAATTCCGATTG、

0.500?μl的20μM羊肉的環引物1：GTTATTTAAACCGGTTAG、

0.500?μl的20μM羊肉的環引物2：AATTATCGCTT?TCTCTACATC?CAGC、

4.000?μl?的25mM?MgCl_2?、

4.000?μl?的5M甜菜堿、

余量為滅菌蒸餾水；

其中，10×Lamp?buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/?pH?8.8、?100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100；

（6）反應液B：1000×的熒光染料?SYBR?Green?Ⅰ。