[發明專利]乳酸片球菌的N-乙酰神經氨酸醛縮酶及其基因與應用

無效

• 申請號: 201210186931.6
• 申請日: 2012-06-07
• 公開（公告）號: CN103060301A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 林白雪;張子娟;陶勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所;中科鴻基生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N15/11;C12P19/02
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種N-乙酰神經氨酸醛縮酶及其編碼基因與應用，特別涉及來源于乳酸片球菌的N-乙酰神經氨酸醛縮酶及其基因與應用。

背景技術

唾液酸(Sialic?acid)是一類神經氨酸的衍生物，目前已經發現的天然的唾液酸衍生物達40多種。其中最主要的是N-乙酰神經氨酸（N-acetyl-D-neuraminic?acid,Neu5Ac）。Neu5Ac通常位于細胞表面糖蛋白和糖脂的糖鏈非還原末端，在許多與糖和蛋白相互作用有關的生理過程中起著很重要的作用：如細胞的粘附、信號傳遞、糖蛋白的穩定性、細菌致病性、病毒侵染、炎癥和腫瘤的轉移等。N-乙酰神經氨酸的生物學功能多樣化，在治療流感、神經性疾病、炎癥和腫瘤等方面具有重要的醫藥價值，特別是在流感（包括禽流感H5N1和2009年的H1N1）的預防和治療方面有良好的效果。同時，N-乙酰神經氨酸可促進神經突觸的發育，對嬰幼兒腦部發育非常重要，因此也被用于嬰幼兒奶粉添加劑。無論是藥用前景還是作為食品添加劑，N-乙酰神經氨酸都具有較高的市場價值。

N-乙酰神經氨酸可從以下幾種途徑獲得：天然產物提取、化學合成、化學酶法、酶法合成等。N-乙酰神經氨酸可從燕窩、牛奶或者禽蛋中提取，但由于量太少，提取純化難，產量低（10-20％），純度低。

化學合成法合成N-乙酰神經氨酸，由于產物結構的復雜性，需要繁多的保護和去保護步驟。使用化學法合成N-乙酰神經氨酸反應條件苛刻，需要銦等一些貴重金屬作為催化劑，N-乙酰神經氨酸得率低。因此，化學法常常和酶法結合使用。

N-乙酰神經氨酸可通過酶法合成，N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）和丙酮酸在N-乙酰神經氨酸醛縮酶（Neu5Ac?aldolase?or?Neu5Ac?lyase,NanA，EC4.1.3.3）作用下生成N-乙酰神經氨酸。但ManNAc對于工業生產而言成本較高。化學酶法是一種更經濟有效的生產N-乙酰神經氨酸的方法，即在堿性條件下，使N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）異構化生成ManNAc；然后采用N-乙酰神經氨酸醛縮酶催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經氨酸。或用雙酶法合成：即用GlcNAc?2-異構酶（GlcNAc?2-epimerase，AGE，EC5.1.3.8）催化GlcNAc異構成ManNAc，然后ManNAc和丙酮酸在N-乙酰神經氨酸醛縮酶的作用下縮合產生Neu5Ac。

在工業生產中多以GlcNAc為原料生產Neu5Ac，不論是采用化學酶法還是雙酶法，都需要N-乙酰神經氨酸醛縮酶。雖然N-乙酰神經氨酸醛縮酶在高等動物及一些微生物中有存在，但是生物體中其含量極微，難以分離得到足夠量的N-乙酰神經氨酸醛縮酶。因此如何獲得性質優良的N-乙酰神經氨酸醛縮酶對N-乙酰神經氨酸的生產非常重要。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種N-乙酰神經氨酸醛縮酶。

本發明所提供的N-乙酰神經氨酸醛縮酶，名稱為PaNanA，來源于乳酸片球菌（Pediococcus?acidilactici），是如下a）或b）的蛋白質：

a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

b）將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由a）衍生的蛋白質。

其中，序列表中序列2由305個氨基酸殘基組成。

為了使上述（a）中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。

表1標簽的序列