[發(fā)明專利]一種草魚呼腸孤病毒RT-LAMP檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210186709.6
• 申請日: 2012-06-07
• 公開（公告）號: CN102703608A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設計）人: 張輝;曾令兵;周勇;范玉頂;徐進;張金風
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院長江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏峰

1.一種草魚呼腸孤病毒?RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括以下成分：

該試劑盒包括以下成分：1×ThermoPol?Reaction?Buffer；BstDNA聚合酶；dNTPs；AMV逆轉錄酶；外引物F3和B3、內引物FIP和BIP、Betaine，MgCl₂，DTT,?1000×SYBR?Green?I;

F3：5^，-?CAGTGTGATCTCGACTTCCG?-?3^，

B3：5^，-?AGACCAACGCGTCAATCG?-3^，

FIP：5^，-?CGGTCGTCTGACGTACACCGTTTTTTGCCGGCATATGGGGTAA?-?3^，

BIP：5^，-?AGTTGGGTCAATTGGCTACGGTTTTTAGCACCATGGTACTGTTCG?-?3^，。

2.一種用權利要求1所述的試劑盒檢測草魚呼腸孤病毒的方法，其步驟是：

1）、病毒RNA的獲取:

采用TRIzol?或TRIzol?LS試劑或柱吸附洗脫法提取樣本總RNA；

2）、RT-LAMP擴增:

采用25μl反應體系：內引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，DTT4mM，MgCl_2?2-10mM，Bst?DNA聚合酶8U，AMV逆轉錄酶5U，模板RNA5μl，1×ThermoPol?Reaction?Buffer，選擇55-65℃和30-120分鐘進行RT-LAMP反應，80℃滅活2分鐘；

3）、檢測結果判定，采用下述三種方式之一：

A、發(fā)生擴增反應時，從dNTPs析出的焦磷酸根離子和反應液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，通過肉眼判斷：檢測管出現明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性；

B、每25μl體系的反應管加1000×SYBR?Green?I?1-2μl，1-5?min觀察結果，反應液變綠為陽性，保持橙色為陰性；

C、取擴增產物，用2%w/v的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示LAMP特征性梯狀條帶，則結果為陽性；如無任何條帶，則結果為陰性。

3.根據權利要求2所述的一種檢測草魚呼腸孤病毒的方法，其特征在于：MgCl_2?的濃度為8mM。

4.根據權利要求2所述的一種檢測草魚呼腸孤病毒的方法，其特征在于：反應溫度為63℃。

5.根據權利要求2所述的一種檢測草魚呼腸孤病毒的方法，其特征在于：模板RNA在95℃5分鐘后置于冰浴中進行預處理。