[發明專利]熱啟動DNA聚合酶及其應用

無效

• 申請號: 201210185814.8
• 申請日: 2012-06-07
• 公開（公告）號: CN102703400A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 辛文;耿亮
• 申請（專利權）人: 北京全式金生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種熱啟動DNA聚合酶及其應用，具體涉及含有兩種DNA結合蛋白的熱啟動DNA聚合酶，屬于生物技術領域。

背景技術

PCR已廣泛應用于分子生物學各個領域，基本步驟包括，變性—退火---延伸。具體：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至引物退火溫度，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在耐高溫DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。經過幾十個循環后就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

熱啟動PCR是提高擴增能力，擴增特異性，擴增靈敏度最好的一種方法。傳統熱啟動PCR技術主要利用兩種方法：抗體封閉法與化學封閉法。兩種方法分別利用化學物質與抗體在常溫下與DNA聚合酶活性中心結合以封閉酶活，在高溫條件下化學物質或抗體失活，釋放酶活，從而實現熱啟動。抗體封閉法是通過抗體特異性封閉酶活性中心，這種方法酶與抗體結合屬于非化學鍵結合，在酶保存過程中，易出現抗體活性降低的風險，而且酶活性中心不是唯一，很難完全封閉酶活。化學封閉法，是通過化學物質與耐高溫DNA聚合酶肽鏈上氨基形成穩定的酰胺鍵，在常溫下可完全封閉酶活性，通過高溫將酰胺鍵水解，釋放酶活。這種方法需要長時間高溫(至少15分鐘)，水解酰胺鍵，長時間高溫容易使DNA聚合酶活性降低；對于痕量模板，長時間高溫易使模板降解。這兩種方法并非實現熱啟動最理想的方法。

發明內容

本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種熱啟動DNA聚合酶，該酶極大地提高了PCR反應特異性、靈敏度。

本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種熱啟動DNA聚合酶在熱啟動PCR反應中的應用。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案為：

本發明提供了一種熱啟動DNA聚合酶，該酶包括：

能夠與引物結合的單鏈DNA結合蛋白；

能夠與DNA模板結合的雙鏈DNA結合蛋白；及

DNA聚合酶。

在本發明所述熱啟動DNA聚合酶中，兩種結合蛋白與DNA序列的結合是非特異性結合。單鏈DNA結合蛋白與PCR體系中單鏈結構的引物結合，而雙鏈DNA結合蛋白與雙鏈結構的DNA模板相結合。結合蛋白后的引物與模板無法形成復合物，也不能與DNA聚合酶相結合，因此無法被DNA聚合酶所利用，從而避免產生非特異性擴增。隨著反應的進行，兩種結合蛋白質在預變性步驟受熱失活，釋放出引物、模板參與PCR反應，使PCR反應正常進行，實現熱啟動。

進一步地，本發明所述的“能夠與引物結合的單鏈DNA結合蛋白”，“能夠與DNA模板結合的雙鏈DNA結合蛋白”可以是現有技術中已經報道的具有該功能的任何單鏈DNA結合蛋白或雙鏈DNA結合蛋白，其可以通過購買或按照現有技術的方法進行制備而獲得。

進一步地，所述單鏈DNA結合蛋白，雙鏈DNA結合蛋白和DNA聚合酶的摩爾比為1-2∶1-2∶10-15。

為了詳細說明本發明的技術效果，本發明在此提供了一種單鏈DNA結合蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，并提供一種雙鏈DNA結合蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

進一步地，為了達到更好的技術效果，所述DNA聚合酶優選為Taq?DNA聚合酶，可以通過購買或現有技術制備獲得，例如Easy?Taq?DNA?Polymerase(北京全式金生物技術有限公司)、TaKaRa?Taq(寶生物工程大連有限公司)或Taq?DNA?Polymerase(天根生化科技有限公司)或所有從克隆有Thermu?aquaticus?DNA?polymerase基因的大腸桿菌誘導表達后，經過蛋白純化分離出的94KD的重組蛋白等。

本發明還提供了上述熱啟動DNA聚合酶在熱啟動PCR反應中的應用。