[發(fā)明專利]含有熒光素酶基因的四膜蟲(chóng)細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210185777.0
• 申請(qǐng)日: 2012-06-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102925464A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王偉;張鵬幸;許靜;梁愛(ài)華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N1/11;C12N15/79;C12Q1/02;C12R1/90
• 代理公司: 山西五維專利事務(wù)所(有限公司) 14105
• 代理人: 楊耀田

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程細(xì)胞株，具體是一種含有熒光素酶基因LUC的四膜蟲(chóng)細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，更具體地說(shuō)是一種含有四膜蟲(chóng)偏愛(ài)密碼子的LUC的四膜蟲(chóng)細(xì)胞株以及該細(xì)胞株對(duì)水體環(huán)境中重金屬污染的監(jiān)測(cè)。

背景技術(shù)

環(huán)境污染問(wèn)題是目前全球最嚴(yán)重的問(wèn)題之一，目前在實(shí)際應(yīng)用中最常用的監(jiān)測(cè)手段是利用儀器對(duì)環(huán)境中重金屬進(jìn)行理化監(jiān)測(cè)，但監(jiān)測(cè)過(guò)程需要明確污染物成分，而且監(jiān)測(cè)結(jié)果不能反映一些關(guān)鍵參數(shù)如生物利用度、毒性及遺傳毒性等，使得檢測(cè)目標(biāo)局限性和檢測(cè)結(jié)果片面性，隨著研究人員對(duì)模式生物的深入研究，提出了全細(xì)胞生物傳感器（WCB）的概念，即用整個(gè)原核或真核細(xì)胞作為一個(gè)報(bào)告體，包括生物受體和生物轉(zhuǎn)換器兩種元件。纖毛類原生動(dòng)物四膜蟲(chóng)傳承了細(xì)菌和酵母等生物用于全細(xì)胞生物傳感器的優(yōu)點(diǎn)外，由于它在營(yíng)養(yǎng)期沒(méi)有細(xì)胞壁，且通過(guò)胞吞和吞噬作用可以更敏感的接觸水環(huán)境中的應(yīng)激物，從而可以產(chǎn)生快速應(yīng)答；另外由于與細(xì)菌和酵母等相比在基因水平上，四膜蟲(chóng)與人類基因的同源性更高，因此可以在環(huán)境毒性試驗(yàn)中作為模式生物替代動(dòng)物試驗(yàn)。

四膜蟲(chóng)金屬硫蛋白（MTT1）啟動(dòng)子能夠被多種重金屬離子誘導(dǎo)表達(dá)，因此能夠作為潛在的環(huán)境污染物應(yīng)答元件。通過(guò)基因重組將GFP基因原位取代部分MTT1基因，在生長(zhǎng)環(huán)境中含有重金屬等應(yīng)激因素時(shí)，細(xì)胞能夠發(fā)出綠色熒光。但不能夠定量檢測(cè)環(huán)境中的污染指數(shù)。通過(guò)重組將螢火蟲(chóng)熒光素酶基因原位取代BTU2基因，在生長(zhǎng)環(huán)境中含有重金屬等應(yīng)激因素時(shí)，細(xì)胞能夠定量檢測(cè)環(huán)境中的污染指數(shù)，但是由于細(xì)胞內(nèi)的金屬硫蛋白對(duì)重金屬的螯合作用，使得工程細(xì)胞的敏感性降低。

如何使檢測(cè)更快速、更敏感是四膜蟲(chóng)細(xì)胞株用于環(huán)境中重金屬的生物監(jiān)測(cè)所面臨的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過(guò)將熒光素酶基因取代MTT1基因，一方面削弱了MTT1原本的解毒反應(yīng)，使得重組細(xì)胞株更加敏感。另一方面，熒光素酶與底物顯色反應(yīng)可以通過(guò)熒光儀定量檢測(cè)環(huán)境中的重金屬污染。

目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有將細(xì)菌、酵母以及四膜蟲(chóng)構(gòu)建的全細(xì)胞生物傳感器用于水環(huán)境生物監(jiān)測(cè)中的報(bào)道，但本發(fā)明構(gòu)建的含有熒光素酶的四膜蟲(chóng)細(xì)胞株還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種含有熒光素酶基因的可誘導(dǎo)表達(dá)的四膜蟲(chóng)細(xì)胞株；并提供一種構(gòu)建該四膜蟲(chóng)細(xì)胞株的方法；以及該細(xì)胞株在檢測(cè)水體環(huán)境中重金屬污染方面的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種熒光素酶基因，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO：2。

本發(fā)明提供的一種含有熒光素酶基因的四膜蟲(chóng)細(xì)胞株，分類命名：嗜熱四膜蟲(chóng)，拉丁文學(xué)名：Tetrahymena?thermophila,已于2012年5月17日保藏在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為：CGMCC?No.6139。

本發(fā)明含有熒光素酶基因的四膜蟲(chóng)細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

（1）利用四膜蟲(chóng)偏愛(ài)密碼子表將核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1的螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的N-端和C-端序列優(yōu)化為能在四膜蟲(chóng)中高效穩(wěn)定表達(dá)的密碼子，并在序列的N-端加上BamH?I酶切位點(diǎn)，在C-端加上Asc?I酶切位點(diǎn)，合成特異性引物：

上游：5’-ggatcc?agt?gaa?gac?gcc?aaa?aac?atc?aag?aaa?ggc?ccc?gct?cct?ttc?tat?ccg?c-3’（SEQ?ID?NO：3）

下游：5’-ggcgcgcc?tca?gac?ggc?gct?ctt?acc?acc?ctt?ctt?ggc?ctt?gat?gag?gat-3’（SEQ?ID?NO：4）

經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得優(yōu)化的螢火蟲(chóng)熒光素酶基因LUC，將LUC基因連接到過(guò)表達(dá)載體pBX中，獲得重組質(zhì)粒pBX-LUC；

（2）將重組質(zhì)粒pBX-LUC純化、濃縮并由Xho?I酶切線性化后，應(yīng)用基因槍粒子轟擊法轉(zhuǎn)入饑餓18-24h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜熱四膜蟲(chóng)B2086中進(jìn)行基因重組，通過(guò)增加巴龍霉素濃度篩選含有螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的重組嗜熱四膜蟲(chóng)細(xì)胞株；

（3）在細(xì)胞株可生長(zhǎng)的最大濃度巴龍霉素條件下，吸取單細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得大量細(xì)胞株B2086-LUC，并將其凍存在液氮中。

該細(xì)胞株在生長(zhǎng)的環(huán)境中存在重金屬污染時(shí)，誘導(dǎo)MTT1基因的啟動(dòng)子啟動(dòng)螢火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)，熒光素酶能夠和底物反應(yīng)，快速顯色，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單快速。