[發明專利]一種miRNA的原位雜交探針及其檢測試劑盒和應用

有效

• 申請號: 201210185570.3
• 申請日: 2012-06-06
• 公開（公告）號: CN102732619A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 李江超;關新元;李焱
• 申請（專利權）人: 中山大學腫瘤防治中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 曹愛紅

技術領域

本發明涉及分子檢測領域，具體涉及一種miRNA的原位雜交探針及其檢測試劑盒和應用。?

背景技術

原位雜交技術是根據核酸分子堿基互補原則，將標記的DNA或RNA探針與經過變性后的單鏈DNA片段或組織、細胞上特定的核苷酸序列，在適宜條件下結合形成專一的核酸雜交分子，再經過相應的檢測手段，將待測核酸在染色體、組織或細胞上的位置顯示出來。原位雜交技術是由Gall和Parue(1969)利用標記的rDNA探針與非洲爪蟾細胞核雜交首次獲得成功。隨著植物染色體制備技術的改進，Rayburn(1985)最早將非放射性檢測系統應用到植物染色體原位雜交。目前，該技術在基因定位、多倍體起源、非整倍體鑒定以及系統進化和親緣關系等方面均得到廣泛應用。?

現有的原位雜交探針包括DNA探針、寡聚核苷酸探針、RNA探針，這些探針需要信號級聯放大反應才能觀察結果，而且要有一定的Tm值才能保證實驗的正確性和準確性。而且為了增強信號，目前多采取長的核酸序列做為探針的靶向序列或采用信號擴大系統。?

miRNA是短的非編碼的RNA，是致癌基因或抑癌基因的潛在調節子。RT-PCR、Northern印跡法以及生物芯片可以檢測miRNA的表達量，但是并不能檢測在單個細胞中miRNA的表達也不能在原位研究moRNA的表達，達到研究miRNA在癌細胞增殖或凋亡的機制的目的。為了驗證miRNA表達的特異性以及它在癌細胞或癌組織中的定位，需要進行原位雜交。針對miRNA，因為miRNA的片段長度在18－22nt范圍內，比較小，Tm值比較小不能滿足原位雜交的需要，以上方法均不能很好的解決這些問題。目前，為了解決Tm值偏小，丹麥的一家公司生產檢測miRNA的探針，他們的探針是將堿基五碳環上2’氧4’碳亞甲基連接，然后人工合成，該方法有效提高了Tm值，但是其售價昂貴。?

發明內容

為克服上述技術缺陷，并降低經濟成本，本發明的目的是提供一種miRNA的原位雜交探針及其檢測試劑盒和應用。?

為實現上述目的，采用如下的技術方案：?

本發明提供了一種miRNA的原位雜交探針，所述雜交探針的堿基五碳環第2位碳原子修飾了氟原子。修飾的探針是其大部分堿基進行2-F修飾，即在第2位碳原子上修飾一個氟原子，提高Tm值；用長18-22nt的序列和microRNA互補作為探針將修飾后的RNA合并到到探針中。其中，修飾位點如下式：?

被氟原子修飾的RNA被合并到所涉及的miRNA探針中?

優選的，所述雜交探針的序列為5’－3’：AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA，其中第3、6、15、20個堿基五碳環第2位碳原子修飾了氟原子。?

優選的，所述雜交探針的序列為5’－3’：TCACGCGAGCCGAACGAACAAA，其中第3、8、13、21個堿基五碳環第2位碳原子修飾了氟原子。?

上述雜交探針的5’和3’端修飾地高辛。?

本發明還提供了一種含有上述的雜交探針的miRNA的原位雜交檢測試劑盒。該還包括對照探針、預雜交液、封閉液和標記物。?

對照探針的序列為5’－3’：AGTCTATGGTATTCAGTACTCA。?

所述預雜交液20ml中含20×SSC?4ml、硫酸葡聚糖4g、去離子甲酰胺10ml、Poly?A(10mg/ml)0.5ml、魚精ssDNA(10mg/ml)0.5ml、tRNA(10mg/ml)0.5ml、1M二硫代蘇糖醇(DTT)2ml、50×Denhardt’s?0.2ml；所述封閉液為：PBS中加入0.1%Triton-X100、3%正常山羊血清、3%BSA；所述標記物為堿性磷酸酶熒光底物。?

本發明所提供的第一種優選探針，其序列為5’－3’：AGCCTATGGAATTCAGTTCTCA，該探針可以應用于制備肺癌細胞系或肺癌組織的miRNA原位雜交檢測試劑盒中。?

第二種優選探針，其序列為5’-3’：TCACGCGAGCCGAACGAACAAA，該探針可以應用于制備食管癌細胞系或食管癌組織的miRNA原位雜交檢測試劑盒中。?

本發明的檢測原理如下：本發明的檢測系統采用了堿性磷酸酶底物發光檢測系統，根據目的核酸模板，設計地高辛標記的2F探針，與目的核酸進行雜交，然后與抗地高辛堿性磷酸?酶復合物進行孵育，洗滌，最后用堿性磷酸酶熒光底物顯色，陽性結果則發出黃綠色熒光。?