[發(fā)明專利]一種應(yīng)用于結(jié)核病快速診斷的糖芯片、其制備方法及采用其的結(jié)核病診斷試劑盒

無效

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• 申請日: 2012-06-07
• 公開（公告）號: CN102707053A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張舒林;余曉麗;孫戰(zhàn)強
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 祖志翔

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥體外診斷試劑領(lǐng)域，更具體地講，涉及一種應(yīng)用于結(jié)核病快速診斷的糖芯片，其制備方法及采用其的結(jié)核病診斷試劑盒。

背景技術(shù)

我國是結(jié)核病的高感染，高發(fā)病率國家，結(jié)核病的患病人數(shù)在世界各國中居于第二位。目前結(jié)核分枝桿菌臨床檢測方法有細菌學(xué)檢測、血清學(xué)檢測和基因診斷。結(jié)核病患者的細菌學(xué)檢測是結(jié)核病診斷、治療及評價治療效果的可能手段，該手段包含BACTEC檢測系統(tǒng)、分枝桿菌生長指示系統(tǒng)、噬菌體報告技術(shù)。該手段的檢測方法即使是在縮短了檢測時間這一缺點后仍存在一些不可能推廣的問題，如需要昂貴的設(shè)備、標(biāo)準(zhǔn)化的細菌等。基因診斷對肺結(jié)核病檢測、結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定、耐藥性監(jiān)測等具有較高的特異性且需要的時間較短，但是因其高特異性反而容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果且有部分實驗手段所需儀器昂貴等因素限制了其的普及，該手段主要包含結(jié)核分枝桿菌DNA擴增法、實時熒光定量PCR技術(shù)、PCR-RFLP、DNA探針技術(shù)和生物芯片技術(shù)。血清學(xué)檢查因其取樣方便、操作簡單、快速、不依賴病原菌的檢查，是臨床診斷結(jié)核病的重要輔助手段，但特異性免疫診斷依賴于特異性抗原。結(jié)核病感染進程中體液免疫動態(tài)變化規(guī)律很復(fù)雜，缺少抗原優(yōu)化組合的理論基礎(chǔ)，而傳統(tǒng)的血清抗體檢測由于標(biāo)記和檢測技術(shù)落后，所以檢測靈敏度不高。

目前商品化的組合抗體檢測試劑盒，多用特異蛋白質(zhì)抗原與血清中的抗體結(jié)合，無法檢測出所有結(jié)核患者血清中抗結(jié)核抗體。這些檢測方法都存在時間、特異性等方面的問題，不能快速準(zhǔn)確的檢測出患者所攜帶的結(jié)核分枝桿菌，給結(jié)核病的治療和控制帶來了很大的不便。因此，尋找快速、準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病的新方法是控制結(jié)核病的重要手段。

糖芯片是繼基因芯片和蛋白芯片之后誕生的新型生物技術(shù)，具有需要的樣品量少、高通量和高特異性等優(yōu)點，其基本原理與基因芯片和蛋白芯片相似,都是基于物質(zhì)之間的特異性作用。它是將多個不同結(jié)構(gòu)的糖分子通過共價或非共價作用固定于經(jīng)化學(xué)修飾的基質(zhì)上，進而對蛋白質(zhì)、糖蛋白等待測樣品進行測試、分析的一類分析方法。優(yōu)越性在于：其一，生物活性穩(wěn)定。糖芯片可在室溫條件下長期保存生物活性不變。其二，應(yīng)用范圍廣泛。把糖芯片技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床上，可對多種傳染性與非傳染性疾病同時進行快速診斷。因為所有的細胞表面都含有糖類物質(zhì)，這些糖類分子在細胞分子的識別過程中起著重要的作用。

具有種屬特異性的結(jié)核分枝桿菌細胞壁成分脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan,LAM）、脂甘露聚糖（lipomannan,LM）是結(jié)核感染過程中重要的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，是結(jié)核分枝桿菌與巨噬細胞和樹突狀細胞作用的重要配體，其作為結(jié)核分枝桿菌的重要抗原，一直是結(jié)核病發(fā)病機制、免疫病理、診斷治療的研究靶點。國外研究者對LAM-IgG檢測用于結(jié)核病診斷做過研究,并開發(fā)出相應(yīng)的診斷試劑盒。國內(nèi)也有學(xué)者開展了類似研究，但多是直接購買國外的抗原或試劑盒開展應(yīng)用評估。依賴進口試劑，價格較為昂貴，限制了此項診斷技術(shù)的應(yīng)用推廣。

本發(fā)明旨在自主開發(fā)的糖芯片技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用肟化反應(yīng)固定糖探針的方法，將純化得到的脂多糖抗原固定在固相載體上，并運用于血清學(xué)診斷，建立一種快速，準(zhǔn)確基于糖芯片技術(shù)的結(jié)核病快速診斷試劑盒，為結(jié)核病防控提供有效手段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種特異性好、靈敏度高且適用于大規(guī)模檢測的基于二種脂多糖類抗原與抗體的結(jié)核病快速檢測方法。

為了解決上述問題，本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于結(jié)核病快速診斷的糖芯片，其包括固相載體，其特征在于，所述糖芯片還包括結(jié)核分枝桿菌脂多糖類抗原探針，所述結(jié)核分枝桿菌脂多糖類抗原探針通過肟化反應(yīng)被固定于所述固相載體上。

在一實施方式中，所述結(jié)核分枝桿菌脂多糖提取自結(jié)核分枝桿菌H₃₇Rv菌株。

在一實施方式中，所述結(jié)核分枝桿菌脂多糖為脂多糖LAM和LM。

在一實施方式中，所述固相載體是經(jīng)過化學(xué)改性的硝酸纖維膜或微孔板。

在一實施方式中，所述固相載體的化學(xué)改性是根據(jù)如下步驟進行：

（1）將固相載體用環(huán)氧硅烷/甲苯溶液浸潤，形成環(huán)氧化物功能的單層膜；

（2）將上述得到的固相載體用α,ω-二胺-聚乙二醇(M_W=2000)溶液處理，使固相載體上覆蓋一層帶伯氨基的聚乙二醇單層分子；

（3）將氨基化的固相載體置于叔丁氧羰基氨氧基乙酸、乙烯和N-羥基琥珀酰亞胺的磷酸緩沖液處理，洗滌后用HCl/醋酸處理，使伯氨基通過化學(xué)改性轉(zhuǎn)換成羥胺。