[發明專利]體外誘導樹突狀細胞成熟和增殖的紅桂木凝集素

無效

• 申請號: 201210185166.6
• 申請日: 2012-06-07
• 公開（公告）號: CN102690783A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 曾麒燕;王婧娉;李璐
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 鄒超賢

技術領域

本發明涉及用植物凝集素誘導樹突狀細胞（DC）成熟和增殖的方法,特別涉及紅桂木凝素誘導樹突狀細胞成熟和增殖的培養基。

背景技術

植物凝集素是一類具高度特異的糖結合活性的蛋白，其最大的特點在于識別糖蛋白和糖脂，特別是細胞膜中復雜結構的糖鏈：即細胞膜表面決定簇。植物凝集素能與動物、植物、微生物細胞發生特異的作用，引起或增強細胞內吞作用或細胞間轉運，誘發一定的生理效應。它可以儲存物質；抵御細菌、真菌、病毒等病原體的入侵；還作為促有絲分裂因子，調節細胞的分裂和生長。由于凝集素能選擇性地識別細胞膜糖脂或糖蛋白糖鏈的不同糖基，在生化、醫學上，植物凝集素常用于細胞的分型、分離、糖蛋白和有絲分裂原的純化、癌化學的研究等。隨著基因工程的發展，植物凝集素已成為一種很有潛力對抗疾病的工具，在免疫學、腫瘤、生物學等方面得到諸多應用。紅桂木凝集素（Artocarpus?Lingnanensis?Lectin，ALL）是我們的相關研究人員對30多種生長在廣西東南部地區的植物種子經過精心篩選出來的植物凝集素，前期研究表明它具有很強的促進T淋巴細胞增殖活性。

在抗腫瘤免疫治療中，DC是目前已知的體內功能最強的抗原提呈細胞，外周的DC攝取外來抗原后，保留并提呈此抗原，同時發生遷移，進入淋巴結內初始T細胞循環池，能顯著地刺激初始型T細胞增殖，啟動、調控、維持免疫應答；能遞呈抗原給MHCI類限制性CD8+和MHC?Ⅱ類限制性CD4+T淋巴細胞，把加工處理的抗原肽提呈在細胞膜表面上，并表達高水平的協同刺激分子和粘附分子，以保證與T細胞結合并促進T細胞的有效激活，誘導特異性免疫反應。DC在體內分布廣泛，但數量少(僅占外周血單個核細胞的1％左右)且分散，但可由CD34+細胞或單核細胞誘導、衍生、增殖培養。目前培養DC的細胞因子組合方案有多種，在培養基中僅加入rhGM-CSF和rhIL-4，只能培養出不成熟的DC。目前通常采用TNF-α、IFN-γ等在體外誘導DC的成熟，而TNF-α價格昂貴。為解決這一問題，我們從正常人外周血分離單核細胞，經重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白細胞介素4(rhIL-4)和紅桂木凝集素聯合誘導培養8d，獲得成熟DC，為DC的進一步研究及應用免疫治療奠定實驗基礎。

經檢索，紅桂木凝集素誘導人外周血樹突狀細胞的成熟和增殖未見報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種體外誘導樹突狀細胞成熟和增殖的紅桂木凝集素。

本發明的又一目的在于利用紅桂木凝集素制備成熟的樹突狀細胞。

本發明是這樣實現的：

一種體外誘導樹突狀細胞成熟和增殖的紅桂木凝集素，其特征在于：添加紅桂木凝集素作為誘導樹突狀細胞成熟和增殖的專用培養基，是在樹突狀細胞培養基中加入誘導因子和紅桂木凝集素；所述樹突狀細胞培養基是含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基；所述的專用培養基紅桂木凝集素的濃度是22-220μg/mL。

以上所述的專用培養基紅桂木凝集素的濃度是44μg/mL。

紅桂木凝集素的誘導樹突狀細胞成熟和增殖的方法，是在樹突狀細胞培養基中加入樹突狀細胞的前體細胞和誘導因子，培養到第6天時，加入紅桂木凝集素，繼續培養2天，制備成熟的樹突狀細胞；所述的前體細胞來自人外周血單個核細胞。

以上所述的誘導因子為GM-CSF和IL-4，誘導因子在加入樹突狀細胞的前體細胞的第一天加入，所述的GM-CSF的濃度為15ng/mL，所述的IL-4的濃度為15ng/mL。

以上所述的培養溫度為37℃，CO₂濃度為5%，濕度為飽和濕度，每2天換一次新鮮的培養基。

本發明的優點和有益效果：

1.本發明利用本教研室自行發現的紅桂木凝集素誘導樹突狀細胞成熟和增殖，所獲得的樹突狀細胞高表達CD83、CD86、CD40、HLA-DR等，抗原遞呈能力增強，因此本發明為進一步開展對DC的深入研究及臨床免疫治療打下了基礎，為臨床實體腫瘤的生物治療提供一條新的路徑，也為進一步開發疫苗增強劑提供了新型有效的途徑。

2.本發明紅桂木凝集素在體外能誘導樹突狀細胞分泌IL-12和TNF-α，從而誘導Th0細胞向Th1方向分化。Th1細胞主要介導細胞免疫反應，在誘發器官特異性自身免疫病，器官移植排斥反應和抗感染免疫中起著重要的免疫調節作用。