[發(fā)明專利]一種高效擴增間充質(zhì)干細胞的新方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210184931.2
• 申請日: 2012-06-06
• 公開（公告）號: CN102876629A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李富榮;齊暉;王云帥;鄧春艷
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市人民醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一類促使間充質(zhì)干細胞體外大量增殖的新方法及應(yīng)用。?

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal?stem?cells，MSCs)是一種具有自我更新和遷徙能力的多能成體干細胞，能夠分化形成多種組織細胞并釋放有益于組織再生修復(fù)的細胞活性因子，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。因其沒有倫理學(xué)的約束，并且可以分化成具有相關(guān)功能的細胞或組織，從而成為實驗和臨床研究的重點。MSCs來源于多種組織，包括骨髓、臍帶血、外周血、脂肪等，但無論哪一種來源，其取材數(shù)量都是有限的，很難滿足臨床移植所需的細胞數(shù)量要求。?

雖然MSCs在臨床治療上的前景和地位已經(jīng)明確，但由于人體內(nèi)干細胞來源數(shù)量有限，僅靠傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法難以在短時間內(nèi)滿足臨床移植上對細胞數(shù)量的要求。因此，MSCs的體外擴增方法的探索一直是干細胞研究領(lǐng)域的熱點問題。國內(nèi)外已竟相開展這方面研究工作，取得了一些進展。目前，Chen等利用旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器擴增人骨髓MSCs，另外添加干細胞因子(Stem?ce?ll?factor，SFC)、白細胞介素-3(Interleukin-3，IL-3)和IL-6，檢測發(fā)現(xiàn)Stro-1+CD44+CD34-的MSCs在8d后可擴增9倍，成纖維細胞集落形成率(Colony-formingefficiency-fibroblast?per?day，CFE-F/day)是未用生物反應(yīng)器擴增的對照組的1.44倍，擴增后的細胞可表達間充質(zhì)干細胞早期標(biāo)志波形蛋白(Vimentin)和Endoglin(SH2)，而分化細胞的標(biāo)志如II型膠原、骨鈣素(Osteocalcin，0c)和C/EBP-α等則未檢測到，并且這些細胞可分化為成骨細胞、成軟骨細胞及成?脂肪細胞。Yu等也利用生物反應(yīng)器成功在體外擴增出MSCs，如利用攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)人胎盤來源的MSCs，與用培養(yǎng)皿擴增的對照組細胞相比較，培養(yǎng)144h后攪拌式生物反應(yīng)器擴增的細胞數(shù)量是培養(yǎng)皿的1.73倍，并且MSCs的表型特征不變。通過氣升式環(huán)流中空纖維膜生物反應(yīng)器對兔骨髓MSCs進行三維動態(tài)培養(yǎng)，7d后可擴增16倍，擴增后大部分細胞呈CD29+、CD44+、CD45-，保持MSCs的表型，并具有較強的成骨、成軟骨和成脂的多向分化能力。這些研究表明，通過生物反應(yīng)器不但可使MSCs在數(shù)量上得到擴增，還能夠保證MSCs維持原本的表型和分化能力，符合臨床移植用MSCs的基本生物學(xué)特征。?

除了生物反應(yīng)器，科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)了其他方法也有助于實現(xiàn)MSCs體外擴增。研究發(fā)現(xiàn)通過表面抗原篩選可以提高MSCs擴增效率。一般認為間充質(zhì)干細胞的表面抗原情況與造血干細胞相反，即CD31、CD34為陰性，CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD106、CD271等為陽性。根據(jù)這一特性，Jarocha等通過免疫磁珠分離純化CD105+CD271+的人骨髓MSCs并擴增，表達CD105和CD271的成纖維細胞集落生成單位(Colony-forming?unitfibroblastic，CFU-F)是未純化細胞的3-4倍。此外，其他一些影響MSCs體外擴增的因素也陸續(xù)被報道。有研究者通過改善培養(yǎng)基質(zhì)實現(xiàn)MSCs的體外擴增，Zangi等用纖維蛋白微珠可有效將MSCs從大鼠骨髓中分離并且擴增。Kocaoemer等用人AB血清和凝血酶激活的富含血小板血漿(Thrombin-activated?platelet-rich?plasma)分別作為擴增用血清，對人脂肪來源的MSCs進行擴增，結(jié)果表明第6代MSCs的擴增倍數(shù)分別為66.6±15.7和68.1±6.7，而用胎牛血清擴增的倍數(shù)僅為24.4±0.7。除基質(zhì)材料與血清的優(yōu)化外，一些生長因子也有利于MSCs的擴增。如Tamama等證實表皮細胞生長因子(Epidermal?growth?factor，EGF)可通過使ERK及AKT磷酸化的途徑刺激人骨髓MSCs增殖，F(xiàn)arre等報道成纖維細胞生長因子-4(Fibroblast?growth?factor-4，F(xiàn)GF-4)可使MSCs的復(fù)制周期顯著縮短且不改變其多向分化潛能。最近，Zscharnack等還發(fā)現(xiàn)氧濃度也可影響MSCs的擴增，他們通過比較5％和20％的氧氣濃度下MSCs的擴增，發(fā)現(xiàn)5％的氧濃度下MSCs形成的CFU-F比20％的氧氣濃度多2倍，并且老化程度也比20％的氧氣濃度輕。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的旨在針對MSCs體外大量擴增，以及在擴增時出現(xiàn)自主分化和伴隨的衰老及遷徙能力減退等問題，提供一種利用低劑量組蛋白去乙酰化抑制劑解決MSCs體外大量擴增的新方法。?