[發(fā)明專利]小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定技術(shù)

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210183911.3
• 申請(qǐng)日: 2012-06-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103255099A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李冰燕;張?jiān)隼?/a>;張鶴美;胡志勇;劉華清
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;G01N33/53
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 曹毅

1.一種小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定技術(shù)，其特征在于，包括以下步驟：

a．小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

步驟1：在超凈臺(tái)下，取4只6?-?8周齡未生育過(guò)的健康雌性C57BL/6小鼠的卵巢，放置在含400?IU/ml青霉素、鏈霉素的PBS（1000?ml雙蒸水,?NaCl?8.0?g,?KCl?0.2?g?,?Na₂HPO₄·12H₂O?3.58?g?,?KH₂PO₄?0.2?g?,?PH為7.4）緩沖液中；

步驟2：用無(wú)菌的PBS溶液輕輕沖洗卵巢3次，剝離卵巢被膜、脂肪組織及殘留的輸卵管組織，將剝離后的卵巢放置在裝有胰酶（0.25?%?胰酶+EDTA,?27℃預(yù)熱）的1.5?ml?EP管中，在37℃含有5?%?二氧化碳的培養(yǎng)箱中消化，為使卵巢表面充分接觸胰酶，應(yīng)盡量使卵巢分離開(kāi)來(lái)；

步驟3：30?min后，從培養(yǎng)箱中取出1.5?ml?EP管，上下?lián)u動(dòng)10次左右，取出卵巢并將其轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝有胰酶（0.25?%?胰酶+EDTA）的1.5?ml?EP管中進(jìn)行第二次消化,在原1.5?ml?EP管中加入完全培養(yǎng)基終止消化，將包含有上皮細(xì)胞的液體離心（1000r/min,5?min），棄上層液，加入1?ml完全培養(yǎng)基緩慢吹打6?-?10次，收集含小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的懸液，移入35?mm培養(yǎng)皿，在37℃含有5?%?二氧化碳的培養(yǎng)箱中孵育；第二次消化的步驟與第一次相同；

步驟4：實(shí)驗(yàn)的第2?d應(yīng)盡量避免移動(dòng)培養(yǎng)皿，利于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，同時(shí)能夠維持細(xì)胞周圍的微環(huán)境穩(wěn)定,在實(shí)驗(yàn)的第3?d根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況換液,早期傳代細(xì)胞培養(yǎng)間隔8?-?10?d按1：2比例傳代，晚期傳代細(xì)胞培養(yǎng)間隔為3?-?5?d按1：5傳代；

b．免疫熒光法定性定量鑒定小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞純度

步驟1：在無(wú)菌超凈臺(tái)中將第2代的?MOSEC用胰酶（0.25%胰酶+EDTA）消化，接種到24孔板中的爬片上，在37℃含有5?%二氧化碳的培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞密度達(dá)到80?%時(shí)，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次；

步驟2：用4%的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30?min后，用1%?TritonX-100穿透10?min再用5%封閉液室溫封閉30?min；

步驟3：加入1：500?稀釋的一抗pan?anti-cytokeratin，在4℃濕盒中過(guò)夜，用PBS漂洗3×3?min；

步驟4：加入1：1000稀釋的二抗山羊抗小鼠?IgG，37℃避光反應(yīng)1.5?h?，再用PBS漂洗3×3?min；

步驟5：?加入10μ?g/ml的DAPI，染色15?min,用PBS漂洗3×3?min，用抗淬滅劑封固，在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察，在100?倍視野下每孔隨機(jī)取20個(gè)視野檢測(cè)，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(?N1)?和細(xì)胞總數(shù)(N)?比值，計(jì)算細(xì)胞陽(yáng)性率，陽(yáng)性率=?N1/?N×100?%,

c．免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞分離效果

步驟1：同一批次的未處理過(guò)的完整小鼠卵巢和用胰酶消化過(guò)的小鼠卵巢分別放到4%甲醛中4℃過(guò)夜；

步驟2：用石蠟包被卵巢后切成10?μm組織切片；

步驟3：將脫石蠟的卵巢標(biāo)本放到0.01?M檸檬酸鈉緩沖液中煮沸10?min，PBS漂洗；

步驟4：滴加正常山羊血清封閉液，待30?min甩去多余液體；

步驟5：滴加1：100?的一抗pan?anti-cytokeratin?150μl，4℃過(guò)夜，PBS漂洗；

步驟6：滴加1：1000?的二抗山羊抗小鼠?IgG?150μ?l，置于37℃?1?h，PBS漂洗；

步驟7：DAB顯色5?-?10?min，PBS漂洗10?min，蘇木精復(fù)染2?min，鹽酸酒精分化，PBS漂洗10?-?15?min?，脫水、透明、封片、鏡檢。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定技術(shù)，其特征在于：所述完全培養(yǎng)基是包含5%?FBS、1%??Penicillin-Streptomycin,10ng/mlmEGF,10%Insulin-Transferrin-selenium-A的DMEM/F12培養(yǎng)基。