[發明專利]檢測結核桿菌藥敏性的方法及培養基

有效

• 申請號: 201210181480.7
• 申請日: 2012-06-05
• 公開（公告）號: CN102703572A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 崔振玲;王潔;胡忠義;陸俊梅;黃曉辰
• 申請（專利權）人: 上海市肺科醫院
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12R1/32
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 劉懿

技術領域

本發明涉及一種檢測結核桿菌藥敏性的方法和培養基，尤其涉及一種可以不加入顯色劑即可觀察結核桿菌藥敏性的方法和培養基。

背景技術

結核桿菌（MTB）是高致死率的傳染病，自上世紀80年代以來，全球結核病疫情出現了急劇惡化，其中重要原因之一是結核桿菌耐藥性，耐藥性已成為治療和控制結核病的巨大障礙，因此，檢測結核桿菌藥物敏感性對于控制疫情、治療疾病、藥物篩選和研發等均極為重要。

WHO推薦的比例法穩定性較好，但是需要4周時間，無法為臨床提供及時的用藥參考；BACTEC?3D方法可在一周內報告結果，但是該方法采用放射性元素，價格昂貴。

張文宏等（《微生物與感染》，2008，3(4)：p204）報道了試驗三磷酸腺苷發光法快速檢測結核分枝桿菌藥敏性，5~7天后檢測敏感菌釋放的ATP，從而判定MTB對藥物的敏感性；彭麗等（《中國防癆雜質》，2005，27(1)：p18）報道了以分支桿菌噬菌體為基礎的噬菌體生物擴增法，利用噬菌體生長快、只能活在分支桿菌中增殖的特性，可大大縮短檢測時間；此外還報道耐藥性基因測定，如PCR-單鏈構象多態性分析、DNA測序、DNA芯片檢測等；雖然上述方法應用前景較好，但是上述對操作條件和操作人員技能要求較高，不利于工業上使用。

2000年，Caviedes等人建立了一種新的MTB耐藥性檢測技術——顯微鏡觀察藥物敏感度檢測技術（MODS），通過倒置顯微鏡對MTB特征性索狀結果進行觀察，來確定MTB的生長，從而進行藥敏判斷，胡忠義、崔振玲等（《中華預防醫學雜志》2011，45(1)：p21）進行了MTB痰涂陽標本直接藥敏實驗，證明MODS技術直接檢測痰涂陽標本中MTB對藥物的敏感度具有快速、準確、廉價的優點，可作為痰涂陽標本直接藥敏檢測方法。

在MODS方法中，將MTB與藥物一起與培養基混合，然后進行培養，所用培養基主要為固體培養基和液體培養基、以及在此基礎上的固液雙相培養基、半流體培養基等，其中液體培養基能夠使MTB廣發接觸營養成分，因此MTB生長較快，但是液體培養基不利于肉眼觀察，一般需要加入顯色劑染色，以判斷結核桿菌是否生長，而顯色劑往往會給MTB帶來毒性，因此影響藥敏性的判斷。

發明內容

針對目前液體培養基、以及檢測結核桿菌藥敏性方法不便于直接肉眼觀察的問題，本發明提供了一種新的檢測結核桿菌藥敏性的方法和培養基。

本發明第一個方面是提供一種檢測結核桿菌藥敏性的培養基，包括液體培養基、促生長組分，所述培養基為酸性，pH值≥4.5。

所述培養基pH值優選為4.5~6.5，更優選為5~6。

其中，所述液體培養基可以是單獨的液體培養基，也可以是來自含有液體培養基的固液雙相培養基、或包括所述液體培養基的混合物。

所述液體培養基如米氏培養基、蘇通培養基、以及其它可用液體培養基、或上述培養基的改良，可以是其中的任意一種或多種的混合，并優選為米氏培養基7H9、7H10、7H11、或上述任意培養基的改良、或其中任意幾種的組合，更優選為米氏培養基7H9、7H10、或上述任意培養基的改良、或其混合物；最有選為米氏培養基7H9、7H10、或其混合物。

所述促生長組分指的是促進結核桿菌生長的營養組分，如牛血清蛋白、小牛血清、酵母提取物、葡萄糖（右旋糖）、氯化鈉、硫酸鎂、氯化錳、油酸、過氧化氫酶（Catalase）等，可以是其中的任意一種或幾種的混合物。

根據本發明所述培養基的一種實施例，所述液體培養基包括米氏培養基，以及用于調節pH值的酸，此外，還可以包括蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、甘油、乳化劑中的任意一種或幾種的混合物；所述酸可以是有機酸或無機酸，并優選為無機酸，如磷酸、鹽酸、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽等，可以是其中的任意一種或幾種的混合物，所述鹽優選為鉀鹽、鈉鹽、或其混合物。

所述蛋白胨可以是來自于動物或植物，如牛肉蛋白胨、魚蛋白胨、大豆蛋白胨等，具體例子包括酪蛋白胨、骨蛋白胨、胰蛋白胨等。

所述乳化劑可以是脂肪酸環氧乙烯酯、多元醇脂肪酸酯、多元醇脂肪酸酯與環氧乙烷縮合物等，如吐溫-20、吐溫-21、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-21、吐溫-80、吐溫-81、吐溫-85等，可以是一種或多種的混合物。

根據所述培養基的另一種優選實施例，所述培養基還包括抗生素，以抑制其它菌的生長，可以是單一抗生素或多種抗生素的混合物，如多粘菌素B、兩性菌素B、萘啶酸、甲氧芐嘧啶、氨芐西林等。

本發明的第二個方面是提供一種檢測結核桿菌藥敏性的方法，步驟包括：