[發明專利]米曲霉GH11木聚糖酶基因耐熱性改造的方法及突變酶的制備

無效

• 申請號: 201210181374.9
• 申請日: 2012-06-05
• 公開（公告）號: CN102703481A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;劉曉彤;李劍芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/69;C12R1/84
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1.一種改造后的源自米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186、歸屬于糖苷水解酶第11家族的木聚糖酶基因AoXyn11A^YQ，其對應的基因和蛋白質序列分別為SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。

2.突變木聚糖酶工程菌的構建方法和表達方法：

(1)突變基因AoXyn11A^YQ及其表達質粒的構建：根據GenBank上AoXyn11A的基因序列設計引物F₁，R₁，F₂，R₂：

F₁：5′-GAATTCTCCACACCCAGTAGCAC-3′，含EcoR?I酶切位點

R₁：5’-AGGTGATTGCTCTACGGCTTCCGGGGTT-3’，

F₂：5’-ACGGGGAATCATTTCGATGCGTGGGCTA-3’，

R₂：5′-GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3′，含Not?I酶切位點

以本實驗室保存的pUCm-T-AoXyn11A為模板，分別以F₁，R₁和F₂，R₂為1，2兩組引物同時進行第一輪PCR，分為PCR1和PCR2兩組；以本實驗室保存的pUCm-T-AoXyn11A為模板，以第一輪PCR1產物和R₂為引物進行第二輪PCR；以第二輪PCR產物為模板，以PCR2產物和F₁為引物進行第三輪PCR；將第三輪PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-AoXyn11A^YQ)；轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序；

將測序結果正確的pUCm-T-AoXyn11A^YQ和pPIC9K質粒均用EcoR?I和Not?I進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-AoXyn11A^YQ，并對重組表達質粒進行序列測定；

(2)GS115/AoXyn11A^YQ重組子的構建、表達及酶活的測定：用Sal?I對pPIC9K-AoXyn11A^YQ進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AoXyn11A^YQ；按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用1.0％甲醇誘導72h；離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經SDS-PAGE檢測均為單一條帶，重組木聚糖酶最適反應溫度為55℃。