[發明專利]一種阿魏酸酯酶基因(Fae-A)的克隆及重組酶的制備

無效

• 申請號: 201210181372.X
• 申請日: 2012-06-05
• 公開（公告）號: CN102703403A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;龔燕燕;唐存多;陳忠法;李劍芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/55;C12N15/10;C12N15/81
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技術領域

本發明涉及來源于宇佐美曲霉(Aspergillus?usamii)E001菌株的一種新型A型阿魏酸酯酶(Fae-A)基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達，屬于生物工程技術領域。

背景技術

阿魏酸(ferulic?acid)的化學名稱為4-羥基-3-甲基-2-苯丙烯酸，是植物界普遍存在的一種酚酸，其在植物細胞壁結構中起著重要的作用，可以在植物細胞壁的木質素與木質素之間、木質素與半纖維素之間、半纖維素與半纖維素之間形成交接，從而構成一個骨架結構，使得整個細胞壁變得堅硬。在谷物的細胞壁中，阿魏酸的單體和多種二聚體主要以酯鍵的形式連接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖殘基上。

阿魏酸酯酶(EC.3.1.1.73)又稱肉桂酸酯酶、肉桂酰酯酶，是羧酸水解酶的一個亞類，也是一種胞外水解酶，是能水解阿魏酸甲酯、低聚阿魏酸酯和多聚阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來的酶。因此，可以利用阿魏酸酯酶作用于植物細胞壁，釋放出游離阿魏酸或者是二聚體阿魏酸，其主要的生理功能有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂及防治冠心病，并具有抗菌消炎以及抗突變和防癌作用。反式阿魏酸在美國、日本已允許用作食品添加劑，目前在醫藥、食品和化妝品工業中廣泛應用。

阿魏酸酯酶的微生物來源廣泛，如黑曲霉、米曲霉、構巢曲霉，青霉類、嗜酸乳酸桿菌等各種絲狀真菌以及細菌。宇佐美曲霉是黑曲霉的一個變種，它具有生長速度快、產孢子少等優點，就前期研究的結果來看，兩個菌種在基因水平上的差異極小。目前對于阿魏酸酯酶的研究，主要集中于對原始菌株培養條件的優化以增加產酶量或者是提高酶活，也有一部分研究者采用基因工程技術和蛋白質工程技術來提高阿魏酸酯酶的酶活。

近年來，隨著對自然界半纖維素資源的開發利用，尤其是反式阿魏酸優越的生理功能，人們對不同來源和不同特性的阿魏酸酯酶進行了深入地研究，阿魏酸酯酶的應用領域得到了不斷地拓展，除了在食品方面的利用，其在造紙、飼料、紡織、釀酒、醫藥、環境和能源等工業領域逐步開始了廣泛的應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種源于Aspergillus?usamii?E001的新型A類阿魏酸酯酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達的方法，為該阿魏酸酯酶的產業化生產奠定理論基礎。根據氨基酸序列以及底物特異性等，將阿魏酸酯酶分為A、B、C、D四類，Shin等研究表明這四類阿魏酸酯酶都含有不同的保守序列和基序。根據同源比對，A.usamii?E001分泌的為A型阿魏酸酯酶，命名為Aus?Fae-A，其相應的基因命名為Aus?Fae-A。

A.usamii?E001菌株由江南大學篩選和保藏，已于2005年在《食品與發酵工業》雜志的Vol.31，No.4，Pg.50公開，本發明人承諾該菌株在20年內向公眾發放。

本發明的技術方案：一種源自A.usamii?E001的新型的A類阿魏酸酯酶(Aus?Fae-A)，其基因(Aus?Fae-A)成熟肽cDNA核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1。

所述的由成熟肽cDNA序列所推導的Aus?Fae-A氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2。

所述的重組阿魏酸酯酶的活性測定方法：

于25mL具塞試管中，取5mL粗酶液于加入0.2g去淀粉麥麩(DSWB)，試管中，在40℃下恒溫水浴回旋反應15min，沸水浴中滅酶3min，離心，取1mL上清液(根據釋放出的阿魏酸量稀釋適當倍數)加入9mL無水乙醇，振搖，離心，取上清液用紫外分光光度計在320nm下測定吸光值，同時設置空白對照(5mL粗酶液于沸水浴中滅酶3min，加入0.2g?DSWB于試管中，其他操作步驟同上)，計算酶活時減去酶液中原有的阿魏酸(即空白)。

所述的Aus?Fae-A成熟肽cDNA序列的克隆和表達的方法如下：

(1)從已報道的Aspergillus?niger?CBS?513.88基因組信息中找出編碼黑曲霉A類阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然后對該序列進行開放讀碼框分析和信號肽預測，根據預測的結果設計一對特異性引物，引物序列如下：

FAE-F：5’GAATTCGCTTCCACGCAAGGCATCTC?3’

FAE-R：5’GCGGCCGCTTACCAAGTACAAGCTCCG?3’