[發明專利]一種濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全N-連接糖鏈及其鑒別方法

有效

• 申請號: 201210181029.5
• 申請日: 2012-06-05
• 公開（公告）號: CN102788720A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 李錚;楊剛龍;馬恬然;王曄
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N27/64
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 陳廣民

1.一種濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全N-連接糖鏈的方法，包括以下步驟：

（1）蛋白樣品的預處理

取蛋白樣品加入超濾管并置于配套的離心管中，進行離心，再加入弱堿性清洗液，再次離心從而盡可能去除雜質；另取一離心管，將8～12KD的超濾管倒置于該離心管中，然后離心，收集離出的蛋白，用Bradford方法定量，最后定容至1～5mg/ml，即得到定容的蛋白溶液；

（2）定容的蛋白溶液中糖蛋白全N-連接糖鏈分離

將定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超濾管并置于配套的離心管中，進行離心，然后加入等體積的16M尿素溶液，在恒溫振蕩孵育器中振蕩混合，然后離心；再加入8M尿素溶液至超濾管中并進行離心，棄去離心管中的流出液；然后加入10～100mM?NH₄HCO₃，振蕩混合，離心；將超濾管轉移至新的離心管中，向超濾管中加入反應緩沖液，振蕩混合，再向超濾管中加入PNGase?F酶液，振蕩混合，37℃濕盒中靜置孵育過夜，然后離心；再加超純水至超濾管中后離心，收集流出液，并冷凍干燥，得到已分離的糖蛋白全N-連接糖鏈；

或者，將定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超濾管并置于配套的離心管中，進行離心，加入等體積的16M尿素溶液，振蕩混合，離心；再加入8M尿素溶液至超濾管中，離心，棄去收集管中的流出液；然后加入10～100mM的DTT（二硫蘇糖醇）溶液并振蕩混合，56℃靜置孵育，離心；再加入10～100mM的IAM(碘乙酰胺)或IAA（碘乙酸）溶液并振蕩混合，暗處靜置孵育，離心；再加8M尿素溶液至超濾管中，離心，至少重復1次；然后加反應緩沖液至超濾管中，離心，至少重復1次；將超濾管轉移至新的離心管中，加入用40mM?NH₄HCO₃溶解的PNGase?F酶液，振蕩混合，37℃的濕盒中靜置孵育過夜，然后離心；再加超純水至超濾管中后離心，收集流出液，并冷凍干燥，得到已分離的糖蛋白全N-連接糖鏈。

2.根據權利要求1所述的濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全N-連接糖鏈的方法，其特征在于：所有的超濾管均采用10KD濾膜。

3.根據權利要求2所述的濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全N-連接糖鏈的方法，其特征在于：步驟（1）所述的弱堿性清洗液采用40mM?NH₄HCO₃或者NH₄AC溶液。

4.根據權利要求1至3任一所述的濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全N-連接糖鏈的方法，其特征在于：步驟（2）中所述反應緩沖液采用10～100mMNH₄HCO₃或NH₄AC溶液，或者采用PNGase?F酶解試劑盒中的10×反應緩沖液。

5.根據權利要求4所述的濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全N-連接糖鏈的方法，其特征在于：步驟（2）中，在加入反應緩沖液的同時還加入NP-40，其終濃度為10%（V/V）。

6.根據權利要求5所述的濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全N-連接糖鏈的方法，其特征在于：對于步驟（2）限定的前一種方案，步驟（2）中，在加入10～100mM?NH₄HCO₃，振蕩混合，14,000g離心后，向超濾管中加入PNGase?F酶解試劑盒中的10×變性緩沖液5μl，封口后沸水浴中變性5min；取出后待其回至室溫后，再進行所述向超濾管中加入反應緩沖液的操作。

7.根據權利要求6所述的濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全N-連接糖鏈的方法，其特征在于：步驟（2）中所述向超濾管中加入PNGase?F酶液，其加入量均按照質量比計為，濾膜上的蛋白：酶液=50:1～100:1。

8.根據權利要求7所述的濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全N-連接糖鏈的方法，其特征在于：步驟（2）中所述加入超純水至超濾管中后離心并收集流出液的操作，重復一次。

9.根據權利要求8所述的濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全N-連接糖鏈的方法，其特征在于：步驟（2）的所有離心操作均是在離心機中14,000g離心；所述振蕩混合均是在550rpm的恒溫振蕩孵育器中進行。

10.對按照權利要求1所述方法分離得到糖蛋白的N-連接糖鏈進行鑒別的方法，包括以下步驟：

（3）糖鏈除鹽處理

準備Sepharose?4B：加Sepharose?4B至離心管中，再向該離心管中加入體積比為1:1的甲醇：水溶液，搖勻，離心，棄上清，重復清洗至少1次；再向離心管中加入體積比為5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，搖勻，離心，棄上清，重復清洗至少1次；

向所述步驟（2）得到的糖蛋白全N-連接糖鏈樣品中加入體積比為5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，上樣至Sepharose?4B的離心管中搖勻，25℃振蕩反應；14,000g離心15min棄上清；再加入5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液搖勻，12,000g離心5min，棄上清，重復清洗至少1次；再加入1:1的甲醇：水溶液搖勻，25℃振蕩，12,000g離心15min，收集上清，并冷凍干燥；

（4）分析樣品中的全N-連接糖鏈結構

取50%甲醇溶液完全溶解經步驟（3）處理后的糖蛋白全N-連接糖鏈樣品，然后點樣于MTPAnchorchip?384點的靶板上，真空抽干；再加20mg/ml的基質DHB至樣品板上，真空抽干；用多肽校正混合物作為外標校正質譜儀；以反射陽性離子模式鑒定多糖，一級質譜方法參數如下：離子源1，7.50KV；離子源2，6.75KV，反射電壓1，29.5KV；反射電壓2，13.95KV；LIFT1，19KV；LIFT2，3.7KV；激發光源為N2激光，分子量檢測范圍為700-6800；檢測時每個樣品在多點采集圖譜，每個圖譜掃描1500次，最后將所有譜圖疊加得到最后的多糖一級圖譜；從一級圖譜中選擇質譜峰進行二級質譜分析，其分析方法參數如下：離子源1，25KV；離子源2，22.40KV；反射電壓1，26.45KV；反射電壓2，13.35KV；LIFT1，19KV；LIFT2，3.7KV；

（5）復雜糖鏈樣品的MALDI結果分析

采用SimGlycan?4軟件，選擇目標前體離子分析其二級圖譜，分析參數為：選擇前體離子分子量，電荷狀態，陽性離子化模式，加和Na⁺，前體離子容忍度為1，碎片離子容忍度為0.5，無化學衍生化，無還原端修飾；分析后得到可能的糖鏈結構，選擇其中得分最高即最可能的糖鏈結構，軟件中同時提供糖鏈及其碎片的具體結構，結果用Glycanworkbench繪制二級碎片和一級質譜結果，并標注于圖中。