[發(fā)明專利]一種快速檢測海參腐皮病主要病原菌燦爛弧菌的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210180802.6
• 申請日: 2012-05-29
• 公開（公告）號: CN103451275A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 焦緒棟;秦松;孫秀娟;蔣婷;李莉莉;王義鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/63
• 代理公司: 沈陽優(yōu)普達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 21234
• 代理人: 俞魯江

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于養(yǎng)殖海參腐皮病綜合癥病原菌的檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種快速檢測海參腐皮病綜合癥之主要病原菌燦爛弧菌的方法。

背景技術(shù)：

據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年因水產(chǎn)養(yǎng)殖病害問題而造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億元。研究開發(fā)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害診斷分析的技術(shù)，尤其是對于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的早期診斷分析試劑(盒)，為實現(xiàn)對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害病原的準(zhǔn)確、靈敏檢測及疫病的早期快速診斷具有很高的實用價值。

海參腐皮病綜合征是一種養(yǎng)殖海參常見病，具有特點發(fā)病廣，涉及所用的刺參養(yǎng)殖區(qū)；發(fā)病快，一旦發(fā)病很快蔓延全池；危害重，可造成90％以上的死亡率等特點。給海參養(yǎng)殖戶造成了很大的損失。關(guān)于海參腐皮病綜合癥病原菌的研究與分析已有文獻(xiàn)報道，其中燦爛弧菌被認(rèn)為是腐皮病綜合征的主要病原之一。在人工感染條件下可以導(dǎo)致健康海參呈現(xiàn)腐皮病的特征。

關(guān)于燦爛弧菌的檢測及分析技術(shù)已有相關(guān)的報道。包括基于16s-23s核糖體RNA間隔序列的PCR檢測方法，基于抗原抗體反應(yīng)的Dot-ELISA方法等。這些方法特異性較強，可以實現(xiàn)燦爛弧菌的快速鑒定。但存在需要昂貴的檢測儀器(基因擴(kuò)增儀)、制備抗體等不足，對結(jié)果的判讀需要一定的生物學(xué)甚至分子生物學(xué)知識，這些限制了其在基層特別是養(yǎng)殖場的推廣應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)的核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated?Isothermal?Amplification，LAMP)是2000年由日本學(xué)者Notomi?T等提出。通過對靶基因的6個不同區(qū)域設(shè)計2對特異性引物，利用具有鏈置換功能的DNA聚合酶，在等溫條件下(65℃左右)實現(xiàn)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)，由于擴(kuò)增的片段很小，擴(kuò)增效率很高，結(jié)果的判定可以通過是否產(chǎn)生焦磷酸鎂白色渾濁來判讀。

由于LAMP具有高靈敏(比傳統(tǒng)PCR高出2～5個數(shù)量級)、高效性(反應(yīng)時間30-60min)、成本低廉(無需PCR儀)、結(jié)果判讀簡單(目視)等優(yōu)越特點，被認(rèn)為是新型的PCR替代技術(shù)。從2003年開始，LAMP逐步應(yīng)用到病原微生物的檢測和傳染性疾病的診斷中。在日本，LAMP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲等疾病的檢測，食品化妝品安全監(jiān)測及進(jìn)出口快速檢疫中，并成功開發(fā)為診斷試劑推向國內(nèi)及國際市場。

LAMP技術(shù)應(yīng)用于食品及水產(chǎn)動物病害的檢測分析的研究中，國內(nèi)業(yè)已有相關(guān)文章和專利報道。如針對貝類中副溶血弧菌的檢測中，研究者以特異性gyrB基因為靶基因設(shè)計引物，對純培養(yǎng)的副溶血弧菌的檢測限度可達(dá)1900CFU/mL；利用霍亂弧菌種特異性的epsM基因和ctxA基因設(shè)計引物，可以快速檢測霍亂弧菌；利用石斑魚虹彩病毒(SGIV)的ORF-041L設(shè)計引物，利用LAMP實現(xiàn)SGIV感染石斑魚的檢測等等。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明首次將LAMP技術(shù)應(yīng)用于海參腐皮病綜合癥病原菌——燦爛弧菌的檢測當(dāng)中，用于克服現(xiàn)有海參海參腐皮病綜合癥主要病原菌——燦爛弧菌檢測技術(shù)的不足，提供一種利用LAMP技術(shù)快速檢測燦爛弧菌的方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案，采用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增檢測方法(LAMP)。

具體的制備步驟為，

1、LAMP模板的制備

將細(xì)菌純培養(yǎng)物依次進(jìn)行離心、清洗、凍融和煮沸，得到LAMP模板。

2、基因序列分析及引物設(shè)計

比照已報道(網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫資料：http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)的弧菌屬細(xì)菌毒力相關(guān)因子，選擇弧菌屬細(xì)菌中普遍存在的鞭毛相關(guān)基因flgF，通過GenBank數(shù)據(jù)庫查找已知弧菌flgF的全基因及蛋白質(zhì)序列。利用DNAMAN軟件對獲得的9株弧菌flgF完整DNA及蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對分析。篩選燦爛弧菌DNA序列中的有別于其他弧菌的特殊區(qū)域。

通過上述分析，選擇燦爛弧菌中保守區(qū)域作為引物區(qū)域。引物設(shè)計采用Primer?premier5.0引物設(shè)計軟件。設(shè)計的LAMP引物序列為：

正向外引物F3：5`-GGATCGCGCACTGTTTCT-3`

反向外引物B3：5`-TGTGCGAAATTATGACCCGG-3`

正向內(nèi)引物FIP：

5`-ACCCGTTGTACTTACGTTGGCAGCCATGAGTGGCGCTAAG-3`

反向內(nèi)引物BIP：

5`-AGCACAAGCACGTTCAATGCAACCGTCATGCTGAAAACACGA-3`。

3、擴(kuò)增反應(yīng)