[發明專利]一種用于抑制豬瘟病毒復制的RNAi及其制備方法

無效

• 申請號: 201210180327.2
• 申請日: 2012-06-04
• 公開（公告）號: CN102660544A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 劉湘濤;陳妍;田宏;吳錦艷;尚佑軍;尹雙輝;王光祥;靳野;張克山;楊順利;劉永杰
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/867;C12N7/04;C12N5/07
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 鮮林

技術領域

本發明涉及抑制豬瘟病毒復制的方法，具體說是由三對shRNA序列組成的一種用于抑制豬瘟病毒復制的RNAi，本發明還包括RNAi的制備方法。

背景技術

豬瘟(Classical?swine?fever,?CSF)是世界范圍內嚴重危害養豬業的傳染病之一。為了區別于非洲豬瘟，歐洲人稱其為“古典豬瘟(Classical?swine?fever,CSF)”。其病原是豬瘟病毒(Classical?swine?fever?virus,?CSFV)。CSFV是RNA病毒，屬黃病毒科(Flaviridae)、瘟病毒屬(Pestivirus)的成員，與同屬的牛病毒性腹瀉病毒(Bovine?viral?diarrhea?virus,?BVDV)和綿羊邊界病病毒(Border?disease?virus,?BDV)在抗原性和結構上關系密切。CSFV是具有囊膜的正鏈RNA（核糖核酸）病毒，具有感染性。CSFV基因組共編碼4種結構蛋白、8種非結構蛋白。結構蛋白編碼區占據病毒基因組5′端的1/3，非結構蛋白編碼區除Npro編碼序列位于基因組5′端外，其余均位于病毒基因組3′端的2/3。一般認為病毒侵染細胞是通過囊膜蛋白與細胞表面受體相互作用形成Infecosome（感染復合體）后進入宿主細胞。然而對CSFV感染細胞的細節尚不甚明了。而傳統的疫苗免疫等措施不能有效地應對豬瘟的暴發和流行，RNAi（核糖核酸干擾）現象的發現及其在抗病毒方面的研究進展，為豬瘟的防制研究開辟了一個新的探索領域。

RNA干擾(RNA?interference,RNAi)是通過內、外源雙鏈RNA觸發的，由19-23bp小分子干擾RNA片段(siRNA)誘導的同源性mRNA（信使RNA）的降解，從而使該基因表達沉默(gene?silence)的過程。它是廣泛存在于動、植物中的序列特異性轉錄后基因沉默，是生物體在進化過程中，抵御病毒感染及因重復序列和突變引起的基因組不穩定性的保護機制，同時也是一種真核生物體內的基因調控機制。分子生物學研究的早期，人們對基因的了解都是通過基因突變而獲得的。近年來，反向遺傳學技術廣泛應用于基因功能的研究，使人們對基因功能的研究取得了飛躍式的發展，但該技術在基因重組方面耗時費力。在如今的后基因組時代，RNAi技術以其獨特的優勢成為分析基因功能的又一種方法，得到了廣泛的認同。近年來，許多學者以人工誘導RNAi的方式進行了病毒復制的干擾研究，取得了良好進展。例如在抗乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、艾滋病毒（HIV）和脊髓灰質炎病毒（Poliovirus）等病毒病的研究中都發現RNA干擾，對于抑制這類病毒的復制效果極好，可能為這類病毒病的治療創立新的、更有效的途徑。但是目前關于RNAi仍有很多問題亟待解決，例如：進行RNAi的時間和靶位點；哺乳類動物中的干擾素反應；RNAi作用的確切機制；脫靶效應等。因此，今后的研究仍然集中在RNAi作用機制的探討上，以及如何改進運用RNAi的方法來研究基因的功能。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術難以控制豬瘟的不足，構建靶向豬瘟病毒基因組的特定保守基因區段的慢病毒載體介導穩定整合的RNA干擾技術，本發明還提供該技術的制備方法。

為解決上述問題，本發明采用了下述技術方案：

一種用于抑制豬瘟病毒復制的RNAi，包含siRNA序列，通過構建shRNA(short?hairpin?RNA即短發夾脫氧核糖核酸)慢病毒表達載體，獲得復制缺陷型慢病毒，用獲得的慢病毒感染PK-15細胞，篩選出具有抑制豬瘟病毒復制的PK-15細胞克隆。

所述序列SEQ?ID?NO:1至?SEQ?ID?NO:6包括：

Npro115:?5’→3’

SEQ?ID?NO:1：T?CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGA

ATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC

SEQ?ID?NO:2：B?CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGA

ATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC

Npro207:?5’→3’

SEQ?ID?NO:3：T?CACCGCCCACTATTAGGCTAGTATACGA

ATATACTAGCCTAATAGTGGGC

SEQ?ID?NO:4：B?AAAAGCCCACTATTAGGCTAGTATATTCG

TATACTAGCCTAATAGTGGGC

NS5B303:?5’→3’?