[發明專利]一種提取普洱茶渥堆發酵過程中微生物總DNA的方法

無效

• 申請號: 201210180253.2
• 申請日: 2012-06-04
• 公開（公告）號: CN102703430A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 陳朝銀;呂昌勇;劉迪秋;葛鋒;韓本勇;熊向峰
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種提取普洱茶渥堆發酵過程中微生物總DNA的方法，屬于微生物領域。

背景技術

普洱茶(Pu-erh?tea)?以云南的大葉茶(C.?sinensis?var.?assamica)等大葉種茶的曬青毛茶?(普洱青茶，Pu-erh?green?tea)為原料，經過后發酵工藝生產而成的散茶和緊壓茶。現代普洱茶生產工藝中渥堆發酵是生產普洱茶的關鍵工序，其生產過程中的微生物種類和數量直接影響普洱茶風味的形成，因此，微生物在普洱熟茶的渥堆發酵中起著重要的作用。然而，目前以形態學和生理生化指標為主要指標的檢測和分類方法由于受到培養條件和模擬培養技術的限制，實際上所能檢測到的微生物與實際上含有的微生物還有較大的差別。近些年，以DNA為主要指針研究環境中微生物的群落組成及基因功能能直接從分子水平對微生物進行研究。如何獲得完整的、純度高的普洱茶渥堆發酵過程中微生物總DNA是對普洱茶中微生物分子生物學研究的基礎。但是由于普洱茶茶葉本身含有很復雜的次生代謝產物，在渥堆過程中在微生物的作用下使普洱茶的成分轉化分解的更為復雜，無機與有機化合物繁多，茶多酚、茶多糖、茶色素等交織混合，加之生產過程粗獷，金屬離子等都存在其中，這些因素都嚴重的影響普洱茶微生物總DNA的高質量提取。因此，建立普洱茶渥堆發酵過程中微生物總DNA的提取工藝對研究其微生物分子生物學研究、普洱茶品質的提升及普洱茶生產工藝的改進都有重要意義。

目前對普洱茶微生物總DNA的提取的主要問題就是微生物以普洱茶茶葉為底物進行復雜的次生代謝，微生物表面甚至體內都粘附殘存有大量的茶多酚、茶多糖、醌類等，使得提取較高質量的微生物總DNA非常困難。按照目前的方法提取出的普洱茶微生物總DNA，提取過程難以避免茶多酚、醌類等與DNA結合，提取出來的DNA雜質含量偏高，不能直接進行PCR擴增等后續分子生物學的研究；目前的方法還存在提取過程中細胞裂解率不充分，DNA與茶多酚、醌類等結合導致提取過程中損失過大等，導致提取率偏低。

發明內容

本發明的目的是提供了一種提取普洱茶渥堆發酵過程中微生物總DNA的方法，該方法通過對普洱茶樣品震蕩洗滌，分離并洗滌微生物，減少茶多酚，醌類，金屬等對DNA提取的影響，獲得高純度，大片段的微生物總DNA，提取出的DNA能直接用于PCR等后續分子生物學的研究。

本發明提供的普洱茶渥堆發酵過程中微生物總DNA的提取方法包括以下步驟：

（1）樣品的預處理：取1-3g普洱茶渥堆發酵過程中的茶葉，剪碎至0.5-1cm，在茶葉中加入20-30mL洗滌緩沖液，靜置20min后，超聲波清洗儀中震蕩處理10-15min，再渦旋震蕩45-60s，取上清液；將上清液置于60-70℃水浴處理3-9min，低速離心后，取上清液高速離心收集菌體，在菌體中加入5-10mL洗滌緩沖液，混勻，再在60-70℃水浴處理3-9min，高速離心收集菌體；重復上述洗滌過程2-3次，直到菌體顏色接近白色，離心沉淀后上清液無顏色；?

（2）DNA的粗提：向步驟（1）中所收集到的菌體中加入液氮，使菌體在液氮的作用下結成塊狀，充分研磨后，在普洱茶中以1.0mL/g的量加入DNA提取液，繼續研磨充分后，加入蛋白酶K，55℃水浴處理30min，60-70℃水浴處理45~60min；然后加入等體積的的氯仿-異戊醇混合液，搖勻后10000g離心10min，回收水相，重復提取一次；在回收的水相中加入水相等體積的異丙醇和1/10水相體積的3M醋酸鈉，混勻后-20℃放置30-45分鐘，13000~15000g離心15~20分鐘，沉淀用體積百分比濃度為75%的乙醇洗滌2次，室溫干燥后，加入50~150μLddH₂O，即得粗提的DNA溶液；

（3）DNA的純化：在粗提的DNA溶液中加入RNase?A酶，37℃水浴1-2h，用雙蒸水稀釋至500μL后，加入等體積Tris飽和酚，充分混勻，室溫下10000g離心10min，回收水相并在其中加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，充分混勻，室溫下10000g離心10min，回收水相，在回收的水相中加入2倍水相體積的無水乙醇和1/10水相體積的3M醋酸鈉，混勻后-20℃放置20-30分鐘，最后在13000~15000g下離心15~20分鐘，取沉淀室溫干燥后，加入50-150μLddH₂O，即得純化后的DNA。