[發(fā)明專利]一種MALDI-TOF MS直接檢測(cè)感染尿液病原菌前處理方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210180123.9
• 申請(qǐng)日: 2012-06-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102749233A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王新華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王新華
• 主分類號(hào): G01N1/28
• 分類號(hào): G01N1/28
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及臨床標(biāo)本病原微生物檢測(cè)，屬于微生物學(xué)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

泌尿系統(tǒng)感染(UTIs)在臨床感染率占第二位，而傳統(tǒng)方法(尿培養(yǎng)和鑒定)熬時(shí)比較長(zhǎng)，臨床醫(yī)生往往不會(huì)等待實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，而是選擇廣譜的抗生素進(jìn)行治療，這就造成了臨床細(xì)菌的耐藥率逐年上升。?

UTIs感染診斷主要根據(jù)臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室結(jié)果?；颊咴诹羧?biāo)本前應(yīng)清洗外陰，并取中段尿于無(wú)菌容器內(nèi)。主要實(shí)驗(yàn)室檢查包括：尿液干化學(xué)檢查、尿沉渣分析、涂片鏡檢、革蘭氏染色鏡檢以及尿液培養(yǎng)鑒定?，F(xiàn)在尿培養(yǎng)鑒定被認(rèn)為是最好的方法，尿液接種于培養(yǎng)皿中，孵育18-24h，利用培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出的單個(gè)菌落進(jìn)行鑒定。然而傳統(tǒng)方法熬時(shí)比較長(zhǎng)，花費(fèi)較多，并且會(huì)有60-80％的標(biāo)本是陰性結(jié)果。?

目前，基于質(zhì)譜框架圖譜的基質(zhì)輔助激光解析飛行質(zhì)譜(Matrix-Assisted?Laser?Desorption?Ionization-Time?of?Flight?Mass?Spectrometry，MALDI-TOF)逐漸進(jìn)入臨床，應(yīng)用于微生物檢測(cè)，但檢測(cè)標(biāo)本主要是培養(yǎng)后菌落，細(xì)菌鑒定時(shí)間比傳統(tǒng)方法要早1天。然而，MALDI-TOF?MS很少用于原始標(biāo)本的直接鑒定。本發(fā)明是想通過(guò)對(duì)MALDI-TOF?MS的方法進(jìn)行改進(jìn)，提供一種能夠在30分鐘內(nèi)、直接準(zhǔn)確檢測(cè)出臨床尿液標(biāo)本中病原菌的方法，從而指導(dǎo)臨床用藥。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供MALDI-TOF?MS鑒定感染尿標(biāo)本前處理方法。?

本發(fā)明所涉及的MALDI-TOF?MS鑒定感染尿標(biāo)本前處理方法是在細(xì)菌洗滌、集菌后，利用甲酸和乙腈對(duì)細(xì)菌進(jìn)行蛋白溶出，加樣，干燥后，加基質(zhì)，干燥后上機(jī)檢測(cè)。在保證檢測(cè)準(zhǔn)確的前提下，大大縮短了測(cè)定時(shí)間。?

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：?

取1ml尿標(biāo)本2000×g，離心30秒，取上清。15500rpm，離心5分鐘，取沉淀。無(wú)菌水洗滌1次，干燥，備用。加入5μl甲酸(70％)和5μl乙腈，進(jìn)行蛋白溶出過(guò)程，混勻，取1μl點(diǎn)靶，干燥后加1μl基質(zhì)(α一氰基一4羥基肉桂酸飽和溶液，內(nèi)含50％的乙腈和2.5％的三氟乙酸)，干燥后上機(jī)檢測(cè)。?

檢測(cè)步驟比較精簡(jiǎn)，減少了由于步驟繁瑣所帶來(lái)的細(xì)菌丟失。檢測(cè)流程的簡(jiǎn)化，大大縮短了測(cè)定時(shí)間，為臨床醫(yī)生實(shí)施快速而有針對(duì)性的抗生素治療提供了可靠的證據(jù)。?

附圖說(shuō)明

圖1分別為改進(jìn)方法的尿液中大腸桿菌MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)質(zhì)譜圖和鑒定結(jié)果；?

圖2分別為改進(jìn)方法的尿液中糞腸球菌MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)?質(zhì)譜圖和鑒定結(jié)果。?

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1MALDI-TOF?MS檢測(cè)標(biāo)本前處理?

臨床上留取疑似泌尿系感染患者的清潔中段尿1456份，立即送檢。取1ml尿標(biāo)本2000×g，離心30秒，取上清。15500rpm，離心5分鐘，取沉淀。無(wú)菌水洗滌1次，干燥，備用。加入5μl甲酸(70％)和5μl乙腈，進(jìn)行蛋白溶出，混勻，取1μl點(diǎn)靶，干燥后加1μl基質(zhì)(α一氰基一4羥基肉桂酸飽和溶液，內(nèi)含50％的乙腈和2.5％的三氟乙酸)，干燥后上機(jī)檢測(cè)。?

實(shí)施例2MALDI-TOF?MS分析?

細(xì)菌質(zhì)譜的獲得需要autoflex?III?MALDI-TOF/TOF?MS的激光強(qiáng)度為200Hz，檢測(cè)范圍為2-20kDa。離子的形成需要337nm的氮激光，解析延遲時(shí)間為40ns。每一個(gè)樣本的檢測(cè)，需要500個(gè)激光點(diǎn)被收集和分析(10×50激光照射點(diǎn)來(lái)源于上樣靶的不同位置)。測(cè)定前需要蛋白標(biāo)準(zhǔn)1和多肽標(biāo)準(zhǔn)2的混合物進(jìn)行校準(zhǔn)。標(biāo)本測(cè)定后形成質(zhì)譜圖，經(jīng)MALDI?BioTyper軟件3.0進(jìn)行分析與BioTyper細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，分值范圍為0-3，測(cè)定分值＞1.9，說(shuō)明鑒定到種；1.7＜分值＜1.9，說(shuō)明鑒定到屬；分值＜1.7，則鑒定結(jié)果不可信。?