[發(fā)明專利]一種應(yīng)用miRNA抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210179685.1
• 申請(qǐng)日: 2012-06-01
• 公開（公告）號(hào): CN102766594A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱霓;秦永文;趙仙先;袁文俊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N15/113;C12Q1/02;G01N33/68
• 代理公司: 上海泰能知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá);謝文凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于miRNA的應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種應(yīng)用miRNA抑制炎癥狀態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法。

背景技術(shù)

心血管疾病作為人類的第一殺手，其高發(fā)病率和死亡率一直頗受世界關(guān)注。因此，積極探詢動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制將對(duì)冠心病的治療和預(yù)后起重要作用。迄今為止，人們對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理仍未完全明了。一直以來，科學(xué)界比較公認(rèn)的是內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)學(xué)說。但近年來有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)時(shí)其遷移活性便大大提高，這直接導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣硬化血管的正性重構(gòu)以及促發(fā)了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的血管新生。正性重構(gòu)的動(dòng)脈粥樣硬化血管的特點(diǎn)是具有薄纖維帽、富含血管和脂質(zhì)核心的易損斑塊。易損斑塊處于一種生物不穩(wěn)定狀態(tài)，它的纖維帽以及斑塊內(nèi)豐富血管的破裂出血是引起包括急性心肌梗死在內(nèi)的急性冠狀動(dòng)脈綜合征發(fā)生的罪魁禍?zhǔn)住Ｒ虼耍绾我种蒲仔詢?nèi)皮細(xì)胞的遷移活性一直是預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的焦點(diǎn)之一。

血管內(nèi)皮炎癥發(fā)生的起始階段，在血管緊張素II等血管活性物質(zhì)刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎性活化。活化的內(nèi)皮細(xì)胞主要表現(xiàn)為ETS-1等轉(zhuǎn)錄因子的激活以啟動(dòng)下游血管新生和炎性基因FLT1，VCAM1，MCP1等的表達(dá)。其中ETS-1屬于E26轉(zhuǎn)化特異序列(E26Transformation-specifc?Sequence,ETS)轉(zhuǎn)錄因子家族。該家族成員表達(dá)譜廣泛并且含有相同的ETS功能域，該功能域能夠識(shí)別并特異結(jié)合于含有GGA(A/T)序列的啟動(dòng)/增強(qiáng)區(qū)的基因，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。大量研究表明，轉(zhuǎn)錄因子ETS-1在內(nèi)皮細(xì)胞的激活直接導(dǎo)致了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移活性增高并較易于形成新生血管。Zhan等運(yùn)用ETS-1敲除的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，該模型采用血管緊張素-II刺激后內(nèi)皮募集炎性細(xì)胞的能力以及血管重構(gòu)的程度大大降低，這與ETS-1下游基因VCAM-1,MCP-1,PAI-1和p21CIP的表達(dá)抑制相關(guān)。因此血管緊張素-II的促炎癥血管的新生和血管重構(gòu)作用主要是通過轉(zhuǎn)錄因子ETS-1引起的。

MicroRNA是一類由多細(xì)胞動(dòng)物或植物基因的內(nèi)含子、miRNA獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單位或基因簇編碼的19－25個(gè)核苷酸（nucleotide,nt）大小的內(nèi)源性單鏈RNA，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后水平沉默靶基因的翻譯從而對(duì)生物體基因表達(dá)起到精細(xì)調(diào)節(jié)的作用。如果miRNA與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)匹配完全或接近完全，則該復(fù)合體降解靶mRNA；若兩者序列部分匹配則通過抑制靶mRNA的翻譯來沉默特定基因的表達(dá)。現(xiàn)已明確，它們?cè)谶M(jìn)化上有高度保守性，對(duì)諸如心血管疾病、腫瘤、干細(xì)胞分化和自我更新等生理病理過程起重要的調(diào)控作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用miRNA抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法，該方法工藝簡(jiǎn)單，成本低，采用miR-155有效的抑制了炎癥細(xì)胞的遷移，從而達(dá)到預(yù)防心血管疾病的目的。

本發(fā)明的一種應(yīng)用miRNA抑制炎癥內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法，包括：

(1)篩選miR-155靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證，利用重組血管緊張素II刺激內(nèi)皮細(xì)胞，模擬動(dòng)脈粥樣硬化狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)；

(2)利用miR-155模擬物增加該miRNA在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)量；

(3)利用Western?blot法檢測(cè)miR-155模擬物對(duì)血管緊張素II誘導(dǎo)的ETS-1蛋白表達(dá)的抑制作用；

(4)利用劃痕法對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移進(jìn)行檢測(cè)。

所述步驟（1）中的重組血管緊張素II的濃度為1μM，刺激時(shí)間為6h。

所述步驟（2）中的miR-155模擬物為包含miR-155核酸序列“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，主序列如下：5’-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3’。

有益效果

本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低，采用miR-155有效的抑制了炎癥細(xì)胞的遷移，從而達(dá)到預(yù)防心血管疾病的目的。

附圖說明

圖1為計(jì)算機(jī)軟件分析顯示ETS-1的3’非翻譯區(qū)存在兩個(gè)miR-155的作用靶點(diǎn)；

圖2為miR-155能夠抑制攜帶ETS-1靶序列螢光素酶的相對(duì)活性；

圖3為miR-155能夠抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的ETS-1在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)；

圖4為miR-155有效減少血管緊張素II誘導(dǎo)的炎性內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。

具體實(shí)施方式