[發明專利]用于降低熒光原位雜交法中自體熒光干擾的檢體前處理方法及其試劑套組

有效

• 申請號: 201210177626.0
• 申請日: 2012-06-01
• 公開（公告）號: CN103382499A
• 公開（公告）日: 2013-11-06
• 發明（設計）人: 陳澤卿;黃瓊瑰;李尚恩;徐圣琦
• 申請（專利權）人: 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京天平專利商標代理有限公司 11239
• 代理人: 孫剛

技術領域

本發明提供一種用于降低熒光原位雜交法中自體熒光干擾的檢體前處理方法，尤指其技術上提供一種在熒光原位雜交法(FISH，Fluorescence?In?Situ?Hybridization)的檢體前處理步驟增加第四型膠原蛋白酶(collagenase?type?IV)或彈性蛋白酶(elastase)處理步驟，用以降低人類組織自體熒光現象，提高熒光原位雜交法熒光探針信號的解析度。?

背景技術

熒光原位雜交法(FISH)是臨床診斷常使用的技術，可用于早期診斷、治療方式的選擇或監測疾病的活動。如：乳癌患者使用賀癌平(trastuzumab)治療是依據熒光原位雜交(FISH)檢測人類表皮生長因子受體-2(HER2)基因表現或當免疫組織化學染色(IHC)呈現人類表皮生長因子受體-22+(HER22+)基因時再用熒光原位雜交(FISH)做進一步確認，篩選出對藥物更有療效的患者；此外，在棘皮動物微管結合蛋白4與間變性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因陽性的非小細胞肺腺癌(NSCLC)患者接受間變性淋巴瘤激酶及肝細胞生長因子受體(ALK/C-met)雙靶點小分子抑制劑，克卓替尼(Crizotinib)治療的患者可達90％以上的腫瘤縮小，57％的患者獲得客觀緩解，因此，有效檢測出棘皮動物微管結合蛋白4與間變性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因對于臨床標靶治療有很大的幫助和益處。?

熒光原位雜交法是在不破壞去氧核醣核酸鏈狀結構的原則下，將雙鏈去氧核醣核酸鏈通過變性原位分開，用熒光標定的去氧核醣核酸探針與單鏈去氧核醣核酸鏈進行雜交結合，最后在熒光顯微鏡下直接觀察熒光信號，分析細胞染色體中是否存有此去氧核醣核酸探針所對應的序列。目前，常用標定去氧核醣核酸或抗體的熒光物質為FITC異硫氰酸熒光素、奧勒崗綠(Oregon?green)488、光譜綠(SpectrumGreen)，由于組織具有內源性熒光基團(endogenous?fluorophores)如：膠原蛋白、彈性蛋白、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、黃素單核苷酸(FMN，Flavin?mononucleotide)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD，Flavin?adenine?dinucleotide)及芳香族氨基酸(aromatic?amino?acids)，檢體若帶有強烈的背景自體熒光會直接影響熒光原位雜交術和免疫熒光染色判讀的準確性，此類內源性物質也可吸收類似短波長光而產生激發光，導致此類自體熒光現象所產生的背景光會降低熒光探針或抗體信號和背景熒光的比率，從而?導致熒光訊號的解析度和品質的不良，會影響訊號計數與判讀。?

發明內容

先前熒光原位雜交法檢體前處理步驟是用胃蛋白酶來打斷蛋白質的勝肽鍵，但胃蛋白酶不足改善檢體自體熒光的現象。?

為改善上述問題，本發明提供一種用于降低熒光原位雜交法中自體熒光干擾的檢體前處理方法，包括以下步驟：?

步驟一：福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織；?

步驟二：切片及烘片；?

步驟三：硫氰酸鈉(NaSCN)作用；?

步驟四：在面積24×32mm的組織加入20μl濃度5-10mg/mL第四型膠原蛋白酶或1mg/mL彈性蛋白酶，封片后于37℃作用0.5-1hr，來降解具自體熒光特性的細胞外基質；及?

步驟五：用胃蛋白酶(pepsin)在37℃作用。?

又本發明另提供兩種用于降低熒光原位雜交法中自體熒光干擾的檢體前處理方法的試劑套組，其一取自純度100％的溶組織梭菌(clostridium?histolyticum)所產生的第四型膠原蛋白酶(collagenase?type?IV)100mg溶于10mL的磷酸緩沖液(PBS，phosphate?buffered?saline)后，以濃度10mg/mL在-20℃的溫度下儲存；另一取自豬胰腺(PORCINE?PANCREAS)(≥4.0?units/mg?protein)中的第一型胰彈性蛋白酶(ELASTASE?PANCREATIC?TYPE?I)4mg溶于1mL磷酸緩沖液(PBS，phosphate?buffered?saline)后，以濃度4mg/mL在-20℃的溫度下儲存。?

本發明在熒光原位雜交法(FISH)的檢體前處理步驟增加第四型膠原蛋白酶或彈性蛋白酶處理步驟，來降解具有內源性熒光基團的細胞外基質，可顯著降低人類組織自體熒光現象，提高熒光探針信號解析度，提升熒光原位雜交法的檢驗品質與正確性。?

下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。?