[發(fā)明專(zhuān)利]用于檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210176496.9
• 申請(qǐng)日: 2012-05-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102766212A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁宗輝;曹光彩;彭大鵬;王玉蓮;陳冬梅;陶燕飛;劉振利
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/44
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/44;G01N33/577
• 代理公司: 武漢開(kāi)元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 樊戎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于檢測(cè)分析和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法（ELISA）與試劑盒。

背景技術(shù)

氟喹諾酮類(lèi)藥物是一族人工合成的抗菌藥，由于其抗菌譜廣，抗菌力強(qiáng)而被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)。但是由于不合理用藥及濫用藥物，該類(lèi)藥物的不良反應(yīng)及耐藥菌株的出現(xiàn)給人類(lèi)健康帶來(lái)了潛在的危害，因此歐盟和我國(guó)農(nóng)業(yè)部分別對(duì)該類(lèi)藥物規(guī)定了最大殘留限量（MRL）。

建立殘留檢測(cè)方法是控制藥物殘留的重要手段，目前報(bào)道的氟喹諾酮類(lèi)藥物的殘留檢測(cè)分析方法主要有理化方法、儀器分析法、微生物法及酶聯(lián)免疫法等。理化法缺乏專(zhuān)一性及敏感性，在殘留分析中應(yīng)用不多；微生物法的靈敏度不高，僅限于樣品的初篩（王瑩，2006；李巖松，2005；盧圣欣，2007）；氣相色譜、液相色譜、質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但需要昂貴的儀器設(shè)備、復(fù)雜的樣品前處理，不適用于大批量樣品的殘留分析；90年代發(fā)展起來(lái)的酶聯(lián)免疫分析法不但具有較高的靈敏度和特異性，而且經(jīng)濟(jì)、快速且操作簡(jiǎn)單，比較適合于大量樣品的殘留檢測(cè)。

目前關(guān)于檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物的酶聯(lián)免疫分析大部分是通過(guò)3位的羧基與蛋白偶聯(lián)制備免疫原免疫動(dòng)物后獲得抗體，如Holtzapple等（1997）首次報(bào)道了以沙拉沙星（SAR）為半抗原獲得的單克隆抗體能識(shí)別5種氟喹諾酮類(lèi)藥物（諾沙星、諾氟沙星、萘啶酸、曲伐沙星及二氟沙星）；Duan等（2001）以環(huán)丙沙星為半抗原制備的多克隆抗體LOD為0.32?ppb，對(duì)諾氟沙星的交叉反應(yīng)率為44.6%；Watanabe等（2002）以恩諾沙星為半抗原與蛋白通過(guò)碳二亞胺法偶聯(lián)后制備的單抗能夠在MRL水平以下以親和色譜的形式識(shí)別恩諾沙星；魏東（2007）分別以環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、諾氟沙星及沙拉沙星為半抗原合成免疫原制備抗血清，最終獲得了以沙拉沙星為免疫原的多克隆抗體，該抗體能夠識(shí)別6種氟喹諾酮類(lèi)藥物：沙拉沙星（100%）、諾氟沙星（91.83%）、環(huán)丙沙星（85.7%）、恩諾沙星（77.09%）、達(dá)氟沙星（38.37%）及培氟沙星（47.94%）。可見(jiàn)，上述抗體識(shí)別的氟喹諾酮類(lèi)藥物種類(lèi)不多，難以滿(mǎn)足族特異性檢測(cè)的需求。

近年來(lái)，?Bucknall等（2003）制備了族特異性多克隆抗體，該抗體能夠識(shí)別9種該類(lèi)藥物，其交叉反應(yīng)率分別為：諾氟沙星（100%）、萘啶酸（15%）、恩諾沙星（6%）、氟甲喹（6%）、環(huán)丙沙星（9%）、氧氟沙星（17%）、惡喹酸（40%）、吡哌酸（18%）、依諾沙星（143%）。Huet?A?C等（2006）以SAR為免疫原，以諾氟沙星卵清蛋白偶聯(lián)物（NOR-OVA偶聯(lián)物）為包被原，獲得的抗體能識(shí)別12種氟喹諾酮類(lèi)藥物：SAR（100%）、諾氟沙星（105%）、二氟沙星（64%）、環(huán)丙沙星（17%）、培氟沙星（30%）、氧氟沙星（55%）、達(dá)氟沙星（88%）、恩諾沙星（66%）、馬波沙星（45%）、洛美沙星（24%）、依諾沙星（27%）、萘啶酸（14%）。Wang等（2007）獲得了能夠識(shí)別12種氟喹諾酮類(lèi)藥物的單克隆抗體，分別是環(huán)丙沙星（100%）、恩諾沙星（82%）、諾氟沙星（71%）、氧氟沙星（54%）、達(dá)氟沙星（54%）、培氟沙星（49%）、氨氟沙星（51%）、洛美沙星（40%）、依諾沙星（45%）、氟甲喹（35%）、惡喹酸（40%）、馬波沙星（41%）。

上述抗體及相應(yīng)的ELISA檢測(cè)方法在一定程度上能滿(mǎn)足氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)的需要，但由于不能識(shí)別獸醫(yī)上常用的二氟沙星和沙拉沙星，且對(duì)個(gè)別藥物的交叉反應(yīng)率差異較大，導(dǎo)致檢測(cè)的準(zhǔn)確度難以控制。因此制備一種能夠識(shí)別包括二氟沙星和沙拉沙星的族特異性單克隆抗體，并建立相應(yīng)的ELISA檢測(cè)方法和試劑盒具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種能識(shí)別氟喹諾酮類(lèi)藥物的單克隆抗體和檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒。本發(fā)明還提供所述單克隆抗體在制備檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用以及酶聯(lián)免疫方法和試劑盒在氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。

上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種能識(shí)別氟喹諾酮類(lèi)藥物的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCC?NO:C201149的雜交瘤細(xì)胞5B11所分泌的。

所述的雜交瘤細(xì)胞5B11，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC?NO:C201149。

所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。

包含所述的單克隆抗體的試劑盒。