[發明專利]一種檢測新霉素殘留的膠體金試紙條及其使用方法和應用

有效

• 申請號: 201210176424.4
• 申請日: 2012-05-31
• 公開（公告）號: CN102778563A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 袁宗輝;彭慶娟;彭大鵬;王玉蓮;陳冬梅;陶燕飛;劉振利
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 樊戎

技術領域

本發明屬于獸藥殘留分析和免疫學技術領域，具體涉及一種檢測新霉素殘留的膠體金試紙條及其使用方法和應用。

背景技術

新霉素(Neomycin，NEO)是屬于氨基糖苷類藥物中的一種堿性抗生素。新霉素對第Ⅷ對腦神經具有損害作用，會造成不可逆性耳聾，并且有較強的腎臟毒性，亦可引起機體對維生素A及B₁₂吸收不良，導致維生素的缺乏而引起相關病癥。新霉素在獸醫臨床和畜禽養殖上仍被廣泛應用，尤其是不規范用藥引起畜產品中的新霉素藥物的殘留，會對食品衛生、公共健康產生嚴重威脅。因此各國對動物性產品中新霉素的殘留制定了嚴格的限量標準。

動物組織中新霉素殘留的檢測方法有微生物法，高效液相色譜法，薄層層析法，電泳法和酶聯免疫分析法、免疫層析方法等。在動物性組織基于抗原抗體特異性反應建立起來的免疫層析方法具有樣品預處理簡單，分析時間短，使用方便等特點，在大規模篩選檢測中有廣闊的應用前景。目前，尚未見有新霉素免疫層析試紙條的文獻和專利報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測新霉素殘留的膠體金試紙條及其使用方法和應用。

本發明是基于一種能同時識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體（該單克隆抗體是由雜交瘤細胞EDC/5G04分泌的，雜交瘤細胞EDC/5G04由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC?NO:C201144），通過制備膠體金，標記純化后的抗體，優化各項層析條件等，制備了膠體金試紙條。針對新霉素具有溶于水，微溶或不溶于常見有機溶劑的特點，采用堿性緩沖液作為提取試劑，加熱使蛋白質變性以減少基質的干擾等手段，建立了組織樣品中新霉素的提取方法，進而完成本發明。

上述目的是通過以下技術方案實現的：

一種膠體金試紙條，包括吸收墊、硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊，所述硝酸纖維素膜上設有檢測線和質控線，所述吸收墊、硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊依次粘貼在塑料襯板上，其特征在于所述金標墊包被有膠體金標記的能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體，所述檢測線包被有新霉素包被原，所述質控線包被有羊或兔抗鼠IgG。

所述的能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體是由雜交瘤細胞EDC/5G04所分泌的，所述雜交瘤細胞EDC/5G04于2011年6月29日送交位于湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏號為CCTCC?NO:C201144。

所述的新霉素包被原是由新霉素（NEO）與卵清蛋白（OVA）形成的偶聯物（NEO-OVA）。

所述的膠體金試紙條的使用方法，包括用樣品提取液對組織樣品前處理和用膠體金試紙條進行檢測的步驟，所述樣品提取液為pH10～11的磷酸鹽緩沖液，其配制方法為：準確稱取KH₂PO₄?0.40g，NaCl?20.00g，Na₂HPO₄·12H₂O?13.40g，KCl?0.50，NaOH?0.32g，少量超純水溶解，定容至500mL，所述前處理的方法為：?稱取組織勻漿樣品1g，加入10ml樣品提取液，渦旋混勻，60℃孵育30分鐘，冷卻至室溫并搖勻，以4000轉/分鐘的轉速，室溫離心10分鐘，取上清液。

所述組織樣品為牛奶、雞肉，豬肉、蝦肉、牛肉、羊肉、豬肝中的一種或多種。

所述的膠體金試紙條在新霉素殘留檢測中的應用。

具體步驟如下：

（1）復蘇雜交瘤細胞EDC/5G04，免疫小鼠，制備單克隆抗體，并利用辛酸硫酸銨進行純化。

（2）利用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，優化標記條件，制備膠體金標記的能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體；

（3）將包被原NEO-OVA和羊或兔抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜上；

（4）將待測樣品用緩沖液提取，利用試紙條檢測。