[發明專利]高效表達β-1,4-葡聚糖酶編碼基因的木霉工程菌株及其應用

有效

• 申請號: 201210175568.8
• 申請日: 2012-05-31
• 公開（公告）號: CN103060208A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 李紀順;陳凱;楊合同;扈進冬;李紅梅;魏艷麗;張廣志;周紅姿;趙曉燕;王貽蓮;郭凱
• 申請（專利權）人: 山東省科學院中日友好生物技術研究中心
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;C12N3/00;A01N63/04;A01N25/14;A01P3/00;C12R1/645
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 辛向東

1.一種高效表達?-1,4-葡聚糖酶編碼基因的木霉工程菌株綠色木霉（Trichodermaviride）L-10，其特征在于該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC?No.5938，保藏時間2012年03月27日。

2.如權利要求1?所述的木霉工程菌株綠色木霉（T.?viride）L-10，其特征為利用?-1,4-葡聚糖酶編碼基因glu14，通過REMI法轉化綠色木霉LTR-2，獲得了具有外源功能基因的工程菌株綠色木霉（T.?viride）L-10。

3.如權利要求1所述的木霉工程菌株綠色木霉（T.?viride）L-10，其特征在于重組木霉工程菌株L-10染色體中含有所述?-1,4-葡聚糖酶編碼基因；該?-1,4-葡聚糖酶編碼基因在Genbank登錄序列號為HM130670。

4.如權利要求1所述的木霉工程菌株綠色木霉（T.?viride）L-10，其特征在于選用了含來自構巢曲霉色氨酸合成基因trpC的PtrpC為啟動子，TtrpC為終止子構成的真菌表達載體pSilent/glu14，通過REMI法轉化實現?-1,4-葡聚糖酶在宿主菌的高效表達。

5.如權利要求1所述的木霉工程菌株綠色木霉（T.?viride）L-10的厚垣孢子發酵液的工業生產方法，其特征在于具體步驟和工藝條件如下：?

（1）斜面菌種：采用固體PDA培養基，將工程菌株L-10接種在試管內，28℃培養3～4d；

（2）茄瓶菌種：采用液體PDA培養基，將試管菌種接種在液體三角瓶中，置于搖床上28℃振蕩培養1～2d；

（3）液體培養：采用發酵培養基（羧甲基纖維素鈉1%，玉米粉1%，葡萄糖0.5%，豆餅粉2%，磷酸氫二鉀0.2%，磷酸二氫鉀0.2%，碳酸鈣0.5%，pH6.0），121℃滅菌20min，將三角瓶種接種發酵罐，接種量0.2%，28℃培養，溶氧量40～50%，通氣量1：0.6～0.8，攪拌速度為160r/min，培養30hr后，調整發酵參數：25℃培養，溶氧量20～30%，通氣量1：0.4～0.6，攪拌速度為120r/min，添加0.1%的誘導劑甲醛，避光培養6～8hr，至厚垣孢子量達到2×10⁹個/mL以上時，結束發酵；即獲得所述綠色木霉（T.?viride）L-10的厚垣孢子發酵液。

6.如權利要求1所述的木霉工程菌株綠色木霉（T.?viride）L-10的可濕性粉劑制備方法，其特征在于原料配方如下：

L-10發酵液????????????10mL????????????????????????

麥飯石（300目）???????89g??????????????

羧甲基纖維素鈉????????0.5g

幾丁質粉??????????????0.2g

黃原膠????????????????0.3g??。

7.如權利要求1所述的木霉工程菌株綠色木霉（T.?viride）L-10的應用，其特征在于用于制備防治蔬菜灰霉病、小麥紋枯病以及其他植物真菌病害的生防制劑。