[發明專利]一種禽網狀內皮組織增生癥病毒ELISA抗體檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201210173797.6
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102680682A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 成子強;姜艷萍;王峰
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種禽網狀內皮組織增生癥病毒ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于：試劑盒中包含有：預包被禽網狀內皮組織增生癥病毒囊膜蛋白的酶標板，其中所述的囊膜蛋白是經過原核表達并純化后的env蛋白。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有封閉液、樣品稀釋液、酶結合物、濃縮洗滌液、酶底物溶液、終止液、陽性對照和陰性對照。

3.根據權利要求1或所述的試劑盒，其特征在于：所述的囊膜蛋白是經過原核表達并純化后的env蛋白，其制備方法為：

提取感染了市購REV標準毒株SNV株的DFI細胞DNA，根據REV-env基因序列設計特異性引物：上游引物5’-CCGGAATTCGCCATCCTACAGAAAACAAA-3’，其基因序列如Seq?ID?No：1所示，下游引物5’-CGACTCGAGAACAATATGAGCCCAAACA-3’，其基因序列如Seq?ID?No：2所示，并在引物中分別添加了EcoR?I和Xhol?I酶切位點，以PCR擴增出env基因，將env基因克隆入表達載體pET-28a質粒，得到了重組載體pET-28a-env重組質粒，使用0.2～0.3mmoLIPTG誘導表達出了帶有His標簽的融合蛋白His-env，其分子量為46.3KD，此蛋白以包涵體的形式存在。

4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述的預包被時采用的包被緩沖液為0.05M?pH9.6的碳酸鹽緩沖液其1L溶液中含1.59gNa₂CO₃，2.93g?NaHCO₃，包被量為每孔0.2～0.3μg；

封閉液為質量濃度是2％～3％的脫脂奶粉水溶液，封閉時間為1h；

樣品稀釋液為含有體積濃度為0.5‰的吐溫-20的0.01mol/L及pH?7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)，樣品稀釋倍數為600～700倍，孵育時間為2h；

酶結合物為辣根過氧化物酶-山羊抗雞IgG單抗酶結合物，其稀釋倍數為5000倍，孵育時間為2h；

濃縮洗滌液為含有體積濃度為5‰的吐溫-20的0.1mol/L及pH?7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)；

酶底物溶液為3，3，-5，5，-四甲基聯苯胺溶液，孵育時間為20-30min；

終止液為3mol/L?H₂SO₄溶液。

5.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述的陽性對照為REV病毒陽性雞抗血清；陰性對照為SPF雞血清。

6.如權利要求1所述的一種禽網狀內皮組織增生癥病毒ELISA抗體檢測試劑盒的使用方法，步驟如下：試劑盒內各組分回溫到室溫(18-25℃)，顛倒搖動混合均勻：

1)取出包被板，記錄樣品位置；

2)每空加入300μL封閉液，37℃溫箱孵育1h；

3)用大約350μL稀釋后的洗滌液洗滌微孔共3-5次，洗滌后將孔內液體完全拍干；

4)加100μL不需稀釋的陽性對照血清至A1和B1孔，100μL不需稀釋的陰性對照血清至C1和D1孔；

5)加100μL稀釋好的樣品至相應的孔，所有樣品既可進行雙孔檢測也可進行單孔檢測；37℃溫箱孵育2h；

6)重復步驟3；

7)每孔加100μL酶標羊抗雞抗體(HRPO)，37℃溫箱孵育2h；

8)重復步驟3；

9)每孔加100μLTMB底物溶液，37℃溫箱顯色20-30min；

10)每孔加100μL終止液終止反應；

11)測量其OD450nm吸光值并進行記錄。