[發(fā)明專利]一種快速測定水樣中微囊藻細胞數(shù)目的方法

有效

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• 申請日: 2012-05-28
• 公開（公告）號: CN102721640A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設計）人: 張可佳;李聰;張土喬;張儀萍
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N27/62
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發(fā)明涉及飲用水源的環(huán)境監(jiān)測與保護技術領域，具體涉及采用β-環(huán)檸檬醛為技術指標快速鑒別水樣中微囊藻的存在和測定其數(shù)量的方法。

背景技術

隨著經(jīng)濟的迅速發(fā)展，到20世紀90年代后期，在我國已調查的湖泊中，有88.6%處于富營養(yǎng)狀態(tài)。進入21世紀，湖泊富營養(yǎng)化呈現(xiàn)高速發(fā)展的態(tài)勢。目前我國已經(jīng)發(fā)生富營養(yǎng)化的湖泊面積達5000km²，具備發(fā)生富營養(yǎng)化條件的湖泊面積達到14000km²。由于富營養(yǎng)化水體面臨頻繁暴發(fā)淡水藻水華的問題，因此，以富營養(yǎng)化水體作為飲用水源，會對我國居民的飲水安全造成嚴重威脅。

在淡水湖泊富營養(yǎng)化引起的水華中，以春夏季微囊藻水華最為常見，如我國的太湖流域，微囊藻的生物量占藻類總生物量的90%以上；滇池的微囊藻水華常年不消退，水質腐敗，藻毒素含量居高不下。隨著水體污染的加劇，越來越多的湖泊、水庫甚至河流也時常暴發(fā)水華現(xiàn)象，因此，需要辨別富營養(yǎng)化水體的水華是否由微囊藻引起以及確定微囊藻的數(shù)量。

目前鑒別微囊藻種類和數(shù)量的常用方法是光學顯微鏡計數(shù)法和聚合酶鏈式反應法（PCR）。前者通過檢測者直接觀察辨別藻細胞的種類，并進行計數(shù)，耗費時間和體力較大，尤其是水樣較多時；后者測量精準，但成本較高，操作繁瑣。因此，需要找到一種簡便快捷的方法對引起水華的藻類及其數(shù)量進行快速判斷，在第一時間掌握水華暴發(fā)的數(shù)據(jù)資料，為水環(huán)境的應急處理提供基礎。

β-環(huán)檸檬醛（2,2,6-trimethyl-1-cyclohexene-1-carbonxaldehyde,β-cyclocitral）屬于微囊藻的代謝物，由微囊藻細胞內的β-胡蘿卜素在胡蘿卜素加氧酶的催化下，被氧氣氧化發(fā)生斷鍵反應形成。β-環(huán)檸檬醛是一種揮發(fā)性有機物，在不同濃度下（0.5~80μg/L）嗅味描述不同，當濃度低于1μg/L時，為新鮮的青草味；當濃度為2~10μg/L時，為干草味或木頭味；當濃度大于10μg/L時，為類似煙草的味道。目前普遍認為β-環(huán)檸檬醛具有專屬性，只有微囊藻能產(chǎn)生，因此可以通過檢測β-環(huán)檸檬醛的濃度得到微囊藻的細胞數(shù)量。

發(fā)明內容

本發(fā)明提供了一種快速測定水樣中微囊藻細胞數(shù)目的方法，以微囊藻的特有產(chǎn)出物β-環(huán)檸檬醛為指標，利用固相微萃取和氣相質譜測定水中微囊藻的細胞數(shù)目，該方法在采樣后能快速得到檢測結果，無需前處理，方便快捷，成本低廉。

一種快速測定水樣中微囊藻細胞數(shù)目的方法，包括如下步驟：

（1）取若干個與待測水樣處于同一水域的測試水樣，測量測試水樣中的β-環(huán)檸檬醛濃度和微囊藻細胞數(shù)目，直線線性回歸擬合得到該水域β-環(huán)檸檬醛濃度與微囊藻細胞數(shù)目的標準曲線；

（2）取待測水樣，測量待測水樣中的β-環(huán)檸檬醛濃度，根據(jù)所述的標準曲線，計算得到待測水樣中的微囊藻細胞數(shù)目。

所述的待測水樣與測試水樣取于同一時段內所述水域的不同區(qū)域，或不同時段內所述水域的同一區(qū)域，或不同時段內所述水域的不同區(qū)域。

測量測試水樣中的β-環(huán)檸檬醛濃度和微囊藻細胞數(shù)目，通過線性擬合得到該水域β-環(huán)檸檬醛濃度與微囊藻細胞數(shù)目的標準曲線，該標準曲線線性良好，適用于該水域不同區(qū)域以及與建立所述標準曲線的微囊藻處于同一生長周期的微囊藻細胞數(shù)目的測量。

由于微囊藻喜溫和陽光，一般聚集在水體表面，因此最好采集水面以下0.5m處的水作為樣本，采樣時也可以為其他水深位置，但同一水域的采樣水深應相同。

所采集的水樣不少于100mL，且采集瓶上方不留空氣，4℃環(huán)境保存，并盡快檢測，防止保存過程中微囊藻數(shù)目發(fā)生改變和β-環(huán)檸檬醛的揮發(fā)，影響檢測結果。

作為優(yōu)選，所述步驟（1）中測量測試水樣中β-環(huán)檸檬醛濃度的方法為：利用固相微萃取收集測試水樣中微囊藻細胞產(chǎn)生的全部β-環(huán)檸檬醛，使用氣相質譜法測量β-環(huán)檸檬醛濃度。

固相微萃取利用萃取纖維萃取水樣，進行氣相質譜檢測集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，進樣空白值小，甚至可以忽略，萃取纖維可以重復使用50次以上，成本較低。

本發(fā)明中如無特殊說明，測量β-環(huán)檸檬醛濃度時用的氣相質譜條件為：進樣口溫度180℃；柱壓為90kPa；毛細管柱升溫程序為初始溫度40℃，恒定3min后，以8℃/min的速度升溫至120℃，再以15℃/min的速度升溫至250℃，恒定2min；與質譜接口溫度為250℃；離子源溫度為200℃；不分流進樣；選擇離子檢測模式；離子源為EI（電子電離）。

作為優(yōu)選，所述的氣相質譜內標物為2-異丁基-3-甲氧基吡嗪。