[發明專利]一種骨骼肌特異性MYHC-Ⅱa啟動子及其應用

有效

• 申請號: 201210173385.2
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102676528A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 姜運良;張旭;康麗;王鵬飛;季相山
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分子遺傳學領域，具體涉及了一種骨骼肌特異性表達基因5′調控區特異性MYHC-Ha啟動子及其在轉基因豬中的應用。?

背景技術

真核生物基因表達的時間和水平嚴格按照發育順序進行。某些特定基因表達模式的調節能夠引起轉錄因子與相關元件的特異性結合，成為轉錄起始的關鍵步驟，并最終導致基因的時間和空間表達。編碼組織特異蛋白的系列家族基因嚴格按照組織特異性和發育階段性表達，為基因表達調控機制提供了很好的研究模式。在轉基因動物中，獲得能廣泛應用的特異性啟動子顯得非常重要。但啟動子的特異性由多個元件控制，在不同種類和不同發育時期起關鍵作用的調控元件并不相同，調控元件和反式作用因子之間的相互作用也十分復雜。因此要使外源基因能夠在動物組織中特異高效地表達，必須構建一個可以特異高效表達的動物表達載體，其中啟動子的選擇是重要的條件之一。?

肌球蛋白(myosin)是一組肌肉和非肌肉細胞收縮裝置中的蛋白質，具有ATP酶活性。重鏈的大部分是α螺旋，其頭部具有ATP酶活性，并與肌動蛋白結合，而輕鏈具有激酶活性。肌肉中的肌球蛋白是肌原纖維粗絲的組成單位。頭部具有ATP酶活性，屬于可與肌動蛋白絲相互作用的馬達蛋白質；肌球蛋白也是肌肉的主要組成蛋白質，占肌原纖維總蛋白質的60％。豬的骨骼肌肌球蛋白重鏈基因MYHC-I、MYHC-IIa、MYHC-IIb、MYHC-IIx都位于12號染色體。其中MYHC-IIa由39個外顯子和38個內含子組成，編碼1939個氨基酸。通過克隆該基因啟動子區并在體外分析其啟動特性，利用相關序列構建骨骼肌特異性表達載體是一種有效的方法，但是上述的研究均還處在起步階段，對于轉基因豬的培育和品質提高均沒有起到較好的促進作用。?

發明內容

基于上述的原因，本發明的發明人經過研究發現豬骨骼肌肌球蛋白重鏈基因MYHC-IIa基因5′調控區具有骨骼肌特異性啟動特性，并利用這一特性設計了一種骨骼肌特異性MYHC-IIa啟動子載體，該啟動子可以在轉基因豬的培育中應用。該啟動子載體具有骨骼肌特異性啟動特性，而在除骨骼肌外的多種細胞中均無啟動活性，可見該啟動子在骨骼肌中特異性地啟動下游基因的表達，能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達的要求，為轉基因載體提供了一種重要的元件。?

本發明所提供的骨骼肌特異性表達基因5′調控區特異性啟動子，其基因序列如Seq?IDNo：1所示；?

除了上述的啟動子之外，還可以是該啟動子變體或者片段，但均具有如Seq?ID?No：1所示的基因序列。?

“變體”是指對豬骨骼肌MYHC-II?a啟動子Seq?ID?No：1序列進行一個或者多個堿基的任何取代、變異、修飾、替換、缺失或者添加所產生的序列，該序列仍然表現出類似于Seq?IDNo：1?DNA序列的活性。?

“片段”是指基本豬骨骼肌MYHC-II?a啟動子Seq?ID?No：1序列的一個或者多個區域，其仍然類似于基本DNA序列的活性。?

具有上述序列的啟動子或其變體，或者片段，具有骨骼肌特異性啟動特性，而在骨骼肌之外的多種細胞中均無啟動活性，可見該基因啟動子在骨骼肌中特異性地啟動下游基因的表達，能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達的要求，并能應用于轉基因豬的培育中。?

應用上述的啟動子時，一般采用重組核酸序列，該序列中含有上述的啟動子或其變體，或者片段，這樣就可以使于啟動子下游的目的基因在骨骼肌中特異性表達，作為分析、開發、改造骨骼肌特性的研究模型。還可以利用已有的分子生物學操作技術獲得包含目的基因的重組核酸，通過顯微注射等基因導入技術獲得轉基因胚胎，用于建立轉基因動物。重組核酸序?列中的目的基因，含有下列的至少一種功能基因，主要包括提高肌肉品質基因，加快生長速度基因，抗病基因，提高飼料報酬的基因以及生產特定藥物的基因，這樣就可以在獲得骨骼肌特異性啟動特性之外，提高該重組核酸序列的性能，為轉基因豬的培養提供更多的功能性方向，增加其附加產值，如將去飽和脂肪酸酶基因在該啟動子指導下表達可以特異性提高骨骼肌中不飽和脂肪酸的含量，提高肉品營養價值。?

在獲得了上述的重組核酸序列之后，還可以用其建立特殊的表達系統，以便更好的應用于轉基因豬的培育過程中。將目的基因重組至該啟動子下游，通過基因轉入技術使調控區與目的基因共同整合進染色體中，獲得轉基因動物，在該啟動子作用下目的基因僅在骨骼肌中表達，在其他組織器官中不表達，降低目的基因對動物的影響，提高轉基因的效果。?