[發明專利]轉基因大豆分子標準樣品、其建立方法及應用

無效

• 申請號: 201210173356.6
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102690835A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 曹際娟;徐君怡;曹冬梅;鄭秋月
• 申請（專利權）人: 曹際娟;徐君怡;曹冬梅;鄭秋月
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12Q1/68
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生

技術領域

本發明屬于轉基因食品檢測技術領域，具體涉及轉基因大豆GTS?40-3-2的標準樣品制備、其建立方法及其在檢測轉基因大豆GTS?40-3-2中的應用。

背景技術

轉基因大豆40-3-2(Roundup?ready)是Monsanto的產品。在7個轉基因大豆品系中GTS40-3-2(Roundup?Ready)是目前最多用于食品和飼料的。該品系所改變的性狀為耐除草劑（草甘膦）。在不同國家被批準食用的時間分別為：美國1994年；加拿大、阿根廷、日本、荷蘭、瑞士1996年；烏拉圭1997年；巴西、墨西哥1998年；俄羅斯1999年；韓國、羅馬尼亞2000年；南非2001年。可供人類食用或動物飼用。

近年來，轉基因作物培育技術取得突破進展，陸續推出了一批新品種，在改善農作物品質、提高產量等方面發揮了巨大作用。然而，人們對轉基因食品的安全性問題存在著很多的爭論。轉基因作物的生態風險、可能帶來的環境問題、作為食品對人體健康影響的問題、產品加貼標簽問題、運輸問題、國際貿易問題、知識產權問題等已引起世界廣泛性的關注。轉基因產品的安全性問題已由學術觀點分歧，發展到知識產權、環境問題、經濟問題甚至政治問題。歐盟和一些國家相繼出臺了轉基因產品管理法規，我國于2002年3月開始實施《農業轉基因生物安全管理條例》及其三個配套管理辦法。2001年，歐盟要求對轉基因食品進行標識管理，并提出對非轉基因食品只要不是有意污染，允許含有1%的轉基因產品（閾值），而不用標識。日本、韓國、澳大利亞等不同國家的限量閾值不同，從1%~5%不等。

轉基因食品的檢測是這些旨在保護生物和生態安全、維護消費者權益、促進貿易和經濟健康發展的法規和政策的基本依據，其標準化將為制訂、實施和改進這些法規和政策提供有力保證。國內外轉基因食品的檢測研究剛剛起步，許多問題都有待解決，標準樣品則是該領域尚未解決的重要問題。開展轉基因成分檢驗標準樣品的研制在保證測試結果的可比性和溯源性、保障食品安全、解決貿易爭端，促進經濟發展等方面均具有重要的意義。更為嚴峻的問題是目前國外僅有轉基因大豆粉、轉基因玉米粉MON810等少數幾個品種的標準物質，價格非常昂貴，手續繁多，周轉時間長，不能適時地滿足檢驗檢疫工作的需要；日本正在加緊研制轉基因產品檢測的分子參考標準物質，用于轉基因產品的定量檢測；2005年，國內研制成功了轉基因大豆粉國家二級標準物質，填補了我國在轉基因成分檢測標準樣品方面的空白，但轉基因油菜籽、轉基因玉米、轉基因棉花籽等標準樣品以及分子標準樣品仍是空白。

發明內容

鑒于國內轉基因標準樣品緊缺的狀況，我們研制了轉基因大豆GTS?40-3-2品系分子標準樣品，以及轉基因大豆GTS?40-3-2的Real-Time?PCR檢測試劑盒，包括轉基因大豆GTS?40-3-2檢測基因和陽性標準對照品，本項標準樣品的制備及檢測試劑盒的制備完成，對全面深入的研究解決轉基因成分檢測標準樣品的制備技術和穩定性保證技術，對我國轉基因產品檢測標準樣品的研制，添補該測量領域的空白，具有很重要的現實意義。

采用PicoGreen?DNA熒光定量法進行了合作定值。分別對轉基因大豆GTS?40-3-2品系DNA標準樣品進行了6次的重復測試。經Grubbs檢驗和Cochran檢驗，所有數據均可作為定值依據；經正態性檢驗，這些數據符合正態分布。

轉基因大豆GTS?40-3-2品系簡介

轉基因大豆GTS?40-3-2所含的外源基因有：耐除草劑基因CP4EPSPS，由CaMV35S啟動子和NOS終止子調控。

質粒圖譜為：

本發明通過以下技術路線實現：

本發明的一方面在于：轉基因大豆GTS?40-3-2標準樣品，其按照如下方法制備：

①以轉基因大豆GTS?40-3-2的基因組為模板，分別以SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5為引物，PCR擴增，得到兩個目的片段；

PCR擴增條件：94℃預變性3.0min；94℃變性0.4min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環；72℃?5min；

②將步驟①擴增的兩個目的片段通過人工合成連接在一起之后，再連入質粒載體pMD19-T中；并轉化至JM109感受態細胞中，獲得重組菌株；

③將步驟②獲得的重組菌株提取質粒，進行測序鑒定，鑒定結果以堿基序列中包含序列SEQ?ID?NO：7的質粒所對應的重組菌株為陽性菌株；