[發明專利]一種鴨黃病毒及其滅活疫苗的制備及應用

有效

• 申請號: 201210172184.0
• 申請日: 2012-05-29
• 公開（公告）號: CN102757940A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 王桂軍;占松鶴;耿照玉;張建軍;王漢清;王曉旭;吳啟有;孫裴;徐前明;朱良強;潘鑫
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司 34101
• 代理人: 何梅生;王偉

技術領域

本發明涉及一種抗鴨黃病毒滅活油乳疫苗的制備方法。?

背景技術

自2010年以來，在華東地區首次發生鴨黃病毒感染蛋鴨引發的鴨產蛋下降-死亡綜合癥的流行，并迅速傳播到浙江、安徽、福建、江蘇等省份的主要養殖場，之后傳播到廣東、山東、河南、河北等省市，到目前為止全國大部分主要水禽養殖地區均已受到該病的威脅。鴨子感染該病毒后，主要的臨床表現為：病鴨出現高熱、沉郁、厭食等；蛋鴨出現產蛋量急劇下降甚至停產；肉鴨出現生長遲緩。該病的發病率高達100%，死亡率在5%～10%之間。該病毒屬于黃病毒科、黃病毒屬的坦布蘇病毒。?

該病在我國屬于首次報道，其病原的生物學特性，分子流行病學和分子致病機理等方面的研究均剛剛起步，而該病近年來在我國水禽養殖區域的廣泛流行以及其造成的巨大經濟損失，更應加快研究鴨黃病毒病的疫苗的研究。本發明制備的鴨黃病毒疫苗免疫效果較好，能夠較好的預防鴨黃病毒病。?

發明內容

本發明的目的是制備一種鴨黃病毒滅活疫苗，以預防鴨黃病毒病的流行。?

本發明的目的之一是提供一種鴨黃病毒，該病毒株保藏在中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，保藏名稱為鴨黃病毒AH-F10株，保藏日期：2012年4月18日，保藏編號為：CCTCC?NO:V201213。?

本發明的另一目的是對所發明的鴨黃病毒疫苗進行免疫效果的評價。?

本發明鴨黃病毒滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下：?

將病毒第5代雞胚尿囊液（即上述所收獲的病毒尿囊液）中按體積比加入3‰甲醛于37℃搖床滅活36小時，滅活完成后，按體積比滅活病毒液96份，吐溫-80?4份搖勻，即得制苗用抗原，由它做為下步乳化的水相；白油佐劑做為下步乳化油相；按體積比油相3份、水相1份的比例取油相、水相攪拌乳化，制備成鴨黃病毒滅活油乳劑疫苗，并加入體積濃度1%硫柳汞溶液使之中終濃度為萬分之一，搖勻備用。?

本發明鴨黃病毒的分離方法，其步驟如下：從感染鴨黃病毒的病鴨中無菌采集其卵巢病變組織，將其研磨勻漿后反復凍融三次，12000r/min離心10min。；無菌條件下取其上清液，將上清液經0.22um微孔濾膜過濾除菌后接種10日齡SPF（即無特定病原體）雞胚，0.2mL/?枚，于38℃孵化箱孵育，棄去24小時內接種死亡的雞胚，收獲48小時至120小時內死亡雞胚尿囊液，連續傳至5代，收獲病毒尿囊液備用。?

與已有技術相比，本發明有益效果體現在：本發明制備鴨黃病毒滅活疫苗的毒株分離自安徽地區，病毒能夠在雞胚中穩定的傳代，針對地方流行的鴨黃病毒病具有更好的保護性。本發明所制備的鴨黃病毒滅活疫苗采用成熟穩定的制作方法，具有較好的免疫效果，對動物的不良反應較小，在當下暫無商品疫苗的情況下，適合小規模的養殖單位對鴨群免疫及科研實驗使用。?

本發明建立了瓊擴方法檢驗抗體的效價，檢驗結果重復性好，快速準確。?

附圖說明

圖1是抗原與周圍六孔的瓊擴抗體之間出現清晰的六條相連的沉淀線?

圖2是抗原與2⁰抗血清，2^-1抗血清中間出現清晰的沉淀線?

具體實施方式

以下通過具體實施例對本發明技術方案做進一步解釋說明。?

實施例1?

從安徽區域感染鴨黃病毒的病鴨中無菌條件下采集其卵巢等病變組織，將其研磨勻漿后反復凍融三次，12000r/min離心10min。無菌條件下取其上清液，將上清液經0.22um微孔濾膜過濾除菌后接種10日齡SPF（即無特定病原體）雞胚，0.2mL/枚，于38℃孵化箱孵育，棄去24小時內接種死亡的雞胚，收獲48小時至120小時內死亡雞胚的尿囊液，將收獲的一代病毒尿囊液接種10日齡SPF雞胚，0.2mL/枚，于38℃孵化箱孵育。收獲48小時至120小時內死亡雞胚的尿囊液，獲取第二代病毒尿囊液，如此連續傳至5代，收獲尿囊液備用。?

在收獲的第5代病毒尿囊液中按體積比加入3‰甲醛于37℃搖床滅活36小時，滅活完成后，按滅活病毒液96份，吐溫-80（即聚山梨酯-80）4份搖勻，即為制苗用抗原做為下步乳化的水相；白油佐劑做為下步乳化油相。按體積比油相3份、水相1份的比例取油相、水相攪拌乳化，制備成鴨黃病毒滅活油乳劑疫苗，并加入1%硫柳汞溶液使之終濃度為萬分之一，搖勻備用。?

AH-F10株穩定性試驗?