[發(fā)明專利]谷氨酸鈉生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210171992.5
• 申請(qǐng)日: 2012-05-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102676598A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范永軍;周丙午;周興華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東樂(lè)爾康生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12P13/00
• 分類號(hào): C12P13/00;C12N11/08
• 代理公司: 揭陽(yáng)市博佳專利代理事務(wù)所 44252
• 代理人: 黃鏡芝

1.一種谷氨酸鈉生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）生物合成：將底物谷氨酸鈉溶液與固相酶催化合成生成γ-氨基丁酸溶液，當(dāng)谷氨酸鈉生成γ-氨基丁酸的轉(zhuǎn)化率≥99%時(shí)，離心或過(guò)濾使反應(yīng)液與固相酶分離，得γ-氨基丁酸水溶液；?????

（2）分離純化：生成的γ-氨基丁酸溶液經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，除去反應(yīng)液中的氯化鈉，最后稀氨水洗脫置換游離γ-氨基丁酸；

（3）脫色濃縮：氨基丁酸水溶液活性炭脫色后，趕氨，真空薄膜濃縮，濃縮至γ-氨基丁酸含量230～240g/100ml，得γ-氨基丁酸濃溶液；

（4）結(jié)晶干燥：γ-氨基丁酸濃溶液加入95%酒精，析出γ-氨基丁酸白色沉淀結(jié)晶，離心分離，真空干燥得γ-氨基丁酸白色粉末。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：在生物合成工藝中，所述底物谷氨酸鈉摩爾濃度為100～1000mmorl/L。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述底物谷氨酸鈉與固相酶的配比為100～1000mmorl谷氨酸鈉與1～10萬(wàn)生物效價(jià)的固相酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：在生物合成工藝中，所述合成的底物溶液pH值為3.5～7.5；合成反應(yīng)溫度為25～55℃；反應(yīng)液濾液與活性炭的重量配比為：100∶1～5；所述的γ-氨基丁酸濃溶液與95%酒精的體積比為1∶5～10；結(jié)晶干燥的過(guò)程為在10萬(wàn)級(jí)潔凈環(huán)境下進(jìn)行。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述固相酶由如下工藝制備：

（A）谷氨酸脫羧酶的基因克隆及表達(dá)：

根據(jù)短乳桿菌ATCC?367的谷氨酸脫羧酶（GAD）的基因序列設(shè)計(jì)以下引物：引物一：AATGCATATGGCTATGTTATATGGTAAACACACGCAT?和引物二：AATTGAAGCTTAGTGAGTGAATCCGTATTTTTTAGG，引物一和引物二分別含有內(nèi)切酶位點(diǎn)Nde?I和Hind?III，利用引物一和引物二根據(jù)Bio-Rad公司的iProof?DNA聚合酶的說(shuō)明書擴(kuò)增谷氨酸脫羧酶的基因片段，擴(kuò)增片段經(jīng)前述內(nèi)切酶消化后，連接到前述內(nèi)切酶預(yù)消化的載體pRSET-A（Invitrgen，美國(guó)）上成為質(zhì)粒pRSET-A?GAD，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)菌種中表達(dá)，將轉(zhuǎn)化的菌落轉(zhuǎn)移到50毫升LB培養(yǎng)液，37攝氏度振蕩培養(yǎng)16小時(shí)，離心收集細(xì)胞，大生產(chǎn)時(shí)，將發(fā)酵體積擴(kuò)大至噸級(jí)規(guī)模，管式離心機(jī)連續(xù)離心收集菌體；

（B）酶的純化與固定化：

GAD的純化與固定化：取菌體細(xì)胞以4倍體積的磷酸緩沖液（20mM,?pH7.4）懸浮，800bar高壓破碎兩次，加5M磷酸鉀溶液（pH7.0）至終濃度為1.2M，緩慢攪拌下加1%聚丙烯酰胺及氯化鈣溶液使結(jié)絮，板框過(guò)濾或高速離心去渣，清液為酶粗提物溶液，測(cè)定蛋白含量；以每10mg蛋白/克載體的量向酶溶液加入環(huán)氧型固相酶載體，室溫緩慢攪拌24小時(shí)，棄上清，所得固相酶分別以20mM醋酸鹽緩沖液（pH5.5）、含1M?氯化鈉的20mM醋酸鹽緩沖液（pH5.5）及20mM醋酸鹽緩沖液（pH5.5）洗滌，最后，測(cè)定固相酶的活性。