[發(fā)明專利]梅山豬FUT1基因及其克隆和原核表達(dá)

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210171604.3
• 申請(qǐng)日: 2012-05-29
• 公開（公告）號(hào): CN102911922A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王桂軍;張海運(yùn);陳建文;朱英奇;孫裴;徐前明;王蓓;包文斌;葉蘭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/10
• 分類號(hào): C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責(zé)任公司 34101
• 代理人: 何梅生;王偉

1.一種梅山豬FUT1蛋白，其特征在于，該蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO?1所示。

2.編碼權(quán)利要求1所述的梅山豬FUT1蛋白的基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?2所示。

3.含有權(quán)利要2所述梅山豬FUT1蛋白基因的原核表達(dá)載體。

4.權(quán)利要求3所述的的原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

（1）FUT1基因的克隆

取豬的新鮮肺臟組織，提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA；以cDNA為模板，以FUT1-EcoRI-F1和FUT1-SalI-R1為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物，

所述FUT1-EcoRI-F1和FUT1-SalI-R1引物如下：

FUT1-EcoRI-F1：5′-ggagaattcatgtgggtccccagcc-3′

FUT1-SalI-R1:5′-ccgtcgactcaaggcccagccaacatc-3′；

（2）FUT1基因克隆載體的構(gòu)建

將步驟（1）所獲得回收擴(kuò)增產(chǎn)物和克隆載體pMD-18-T在T4連接酶的作用下，與16℃連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-18-T-FUT1，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli?DH5a菌中，篩選陽性克隆，進(jìn)行序列分析，篩選出序列定正確的陽性質(zhì)粒，獲得含有FUT1基因的pMD-18-T-FUT1重組質(zhì)粒；

（3）FUT1蛋白信號(hào)肽分析及去信號(hào)肽引物設(shè)計(jì)

通過信號(hào)肽預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)FUT1蛋白在1-11氨基酸存在信號(hào)肽；設(shè)計(jì)一對(duì)引物去除信號(hào)肽；上游引物FUT1-EcoRI-F2引入EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物FUT1-SalI-R2引入SalI酶切位點(diǎn)；上游引物FUT1-EcoRI-F2：5′gcacggaattcatgctagtctgtgtt?3′；下游引物FUT1-SalI-R25′caatgtcgactcaaggcccagccaacat?3′；目的片段大小1059b；

（4）FUT1去信號(hào)肽基因的擴(kuò)增

以步驟（2）中所得的重組質(zhì)粒pMD-18-T-FUT1為模板，以步驟（3）所述FUT1-EcoRI-F2和FUT1-SalI-R2為引物體外擴(kuò)增出FUT1基因；25μl反應(yīng)體系包括：模板1μl，2×Tag?PCRmaster?mix?12.5μl，F(xiàn)UT1-EcoRI-F2?1.5μl，F(xiàn)UT1-SalI-R2?1.5μl，dd?H₂O?8.5μl.PCR參數(shù)為94℃5min，然后94℃30s，60℃30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸1min。擴(kuò)增出目的序列，膠回收目的序列；

（5）FUT1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶EcoRI及SalI雙酶切回收的目的片段，同時(shí)將原核表達(dá)載體PGEX-6P-1進(jìn)行雙酶切，再將酶切過的目的片段和載體用T4DNA連接酶16℃連接過夜構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEX-6P1-FUT1；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21菌株，培養(yǎng)后篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切酶切鑒定，篩選出序列定正確的陽性質(zhì)粒，獲得含有FUT1基因的PGEX-6P-1-FUT1的BL21菌株。

5.一種FUT1基因的表達(dá)的方法，其特征在于：將轉(zhuǎn)化有重組表達(dá)質(zhì)粒PGEX-6P-1-FUT1的BL21菌接種到含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜；次日以1％的接種量接種到5mL含100mg/L氨芐青霉素的L?B液體培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)3h后，用終濃度為1mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于37℃在180r/min搖轉(zhuǎn)培養(yǎng)4h；取菌液離心后用PBS重懸，加入2×SDS上樣緩沖溶液，煮沸5min，冰浴5min后離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。