[發明專利]高純度牛胰蛋白酶的制備方法

有效

• 申請號: 201210171304.5
• 申請日: 2012-05-29
• 公開（公告）號: CN102676484A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 冷春生;賈冰;李淑楠
• 申請（專利權）人: 通化東寶藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76
• 代理公司: 北京同達信恒知識產權代理有限公司 11291
• 代理人: 李中奎

1.一種從動物胰臟中制備高純度胰蛋白酶的方法，包括如下步驟：

（1）取動物胰臟，先進行組織破碎，加入至少2倍體積的提取劑，該提取劑是pH?3以上的無機或有機酸，提取至少12小時；

（2）提取后的樣品進行離心，收集上清液體；

（3）將上清液加入鹽析沉淀劑進行沉淀，至沉淀不再析出，得到的沉淀即為粗酶原I；

（4）用磷酸緩沖液溶解粗酶原I，用超濾膜超濾，從超濾開始隨時監測透過液A₂₈₀值，至A₂₈₀<0.5時停止超濾，濃縮樣品至提取劑體積的1/10左右，得到粗酶原II；

（5）將粗酶原II上到已平衡好的離子交換層析柱上，上樣過程隨時監測流出液A₂₈₀值，用Buffer?A平衡3-5倍柱體積，再用Buffer?A和Buffer?B加0.1-0.4mol氯化鈉，進行線性洗脫，流速2-5ml/min，隨時監測流出液A₂₈₀值；收集樣品，于容器中測量體積和A₂₈₀值，得到樣品III，于2-8℃保存備用；該Buffer?A為10m?mol檸檬酸與0.1mol氯化鈉混合得到的pH為4.00±0.02的緩沖液；Buffer?B為10m?mol檸檬酸與0.4mol氯化鈉混合得到的pH為4.00±0.02的緩沖液；

（6）樣品III調pH至堿性后，加氯化鈣進行活化，測A₂₈₀值，隨時檢測活力至活力升至最高時，調pH值至酸性，終止活化，檢測胰蛋白酶活力及胰凝乳蛋白酶活力；測A₂₈₀值，此為樣品IV，于2-8℃保存備用；

（7）將樣品IV用準備好的3-10K超濾膜濃縮，此過程隨時監測透過液A₂₈₀值，然后用Buffer?L將膜中樣品沖出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并濃縮液和沖洗液，即得；該Buffer?L為10m?mol檸檬酸。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的提取劑為0.1-0.15mol/l的硫酸或鹽酸或2-4%的三氯乙酸。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步驟（3）中采用的鹽析沉淀劑為溶解度超過200g/L的無機鹽，或pH?3以下的酸。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述的鹽析沉淀劑為硫酸。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步驟（3）為采用鹽析沉淀劑沉淀進行分級沉淀處理，該分級沉淀處理為在上清液中依序加入20%、40%濃度的鹽析沉淀劑進行分級沉淀。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步驟（4）采用的超濾膜為3k-10k的超濾膜。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（5）為酶原在活化之前上陽離子交換層析，離子交換介質為SP樹脂，平衡緩沖液為Buffer?A，洗脫液為5倍柱體積的Buffer?A和5倍柱體積的Buffer?B，加0.1-0.4mol氯化鈉進行線性梯度洗脫，上樣過程中監測流出液A₂₈₀值＜0.5以下開始梯度洗脫，洗脫后監測A₂₈₀，收集A₂₈₀＞1至胰凝乳蛋白酶活力＜0.2之間的樣品。

8.根據權利要求1所述的制備胰蛋白酶的方法，其特征在于：所述步驟（6）粗酶原樣品III在離子交換層析后，用氫氧化鈉調節至堿性，再加氯化鈣進行活化，該活化的過程為用氫氧化鈉調pH至8.0-8.5，加0.1mol二水氯化鈣活化，然后用鹽酸調pH至2.5-3.0終止活化。

9.根據權利要求1所述的制備胰蛋白酶的方法，其特征在于：所述步驟（7）所用超濾膜為3K超濾膜。

10.根據權利要求1所述的制備胰蛋白酶的方法，其特征在于：所述動物胰臟包括豬、牛、羊的動物的胰臟。