[發明專利]一種γ-亞麻酸的制備方法

無效

• 申請號: 201210167671.8
• 申請日: 2012-05-25
• 公開（公告）號: CN102676594A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 敬科舉;肖秀玲;凌雪萍;沈亮;盧英華
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12P7/64
• 分類號: C12P7/64;C12R1/645
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

1.一種γ-亞麻酸的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1）平板活化培養：無菌條件下，將刺孢小克銀漢霉菌（Cunninghamella?echinulata?ATCC7929）接入活化培養基斜面中，置于培養箱中培養；

2）揺瓶種子培養：將培養好的菌塊接入盛有搖瓶種子培養基的三角瓶中，搖床培養；

3）揺瓶發酵培養：將種子液按10%的接種量接入盛有發酵培養基的搖瓶中培養，并在接種的同時，分別添加核黃素、肌醇、生物素三種維生素濃縮液，使得培養基中核黃素的濃度依次為0、0.1、5、20、35mg/L，培養基中肌醇的濃度依次為0、2、4、6、8、10mg/L，培養基中生物素的濃度依次為0、0.1、5、20、35mg/L；培養溫度為28～30℃，轉速為100～200rpm，發酵時間為168～192h，待菌球有些透明時，取出搖瓶；

4）菌體干重的測定：將發酵液抽濾，清洗，將抽濾所得菌體置于已恒重的稱量瓶中，放入烘箱中烘干后，置于干燥器中，稱重；

5）油脂的提取：將干菌體研磨，并稱取0.5g菌體粉末于比色皿中，加2mL去離子水，混勻后加2.5mL鹽酸，再混勻；將比色皿放入75℃恒溫水浴箱中水??；水浴結束后，加入2.5mL乙醇，混勻，冷卻；再加入6mL乙醚，加塞震搖1min，開塞放氣，再塞好靜置10min，加入1mL石油醚，靜置15min，將上清液取出放入小錐形瓶中；再用5mL乙醚萃取，取出上清液，重復用乙醚萃取直至上清液透明；上清液進行旋轉蒸發，之后放入80℃烘箱中干燥2h，后轉入干燥器冷卻0.5h，稱重得到0.5g菌粉中油脂含量；

6）油脂的甲酯化：取油脂置于50ml的磨口燒瓶中，加入5ml?0.8mol/L?KOH-CH₃OH溶液于65℃水浴回流15min進行皂化；待油珠溶解冷卻后，加入5ml?BF₃-CH₃OH溶液，70℃水浴中甲酯化30min；取出放冷，再加入5ml正己烷振蕩，然后加入足量的飽和食鹽水，靜置分層后取上層正己烷相，抽取上層，并加入無水碳酸鈉脫水；

7）γ-亞麻酸的測定：將上層正己烷用0.22μm的有機膜過濾，各取1μl注入氣相色譜儀，以保留時間定性，峰面積定量，得到γ-亞麻酸。

2.如權利要求1所述的一種γ-亞麻酸的制備方法，其特征在于在步驟1）中，所述培養箱中培養的溫度為28～30℃，培養的時間為7～10d。

3.如權利要求1所述的一種γ-亞麻酸的制備方法，其特征在于在步驟1）中，所述活化培養基為土豆200g/L，食用糖20g/L，瓊脂20.0～30.0g/L。

4.如權利要求1所述的一種γ-亞麻酸的制備方法，其特征在于在步驟2）中，所述搖瓶種子培養基為土豆200g/L；葡萄糖20g/L；(NH₄)₂SO₄?10g/L；吐溫800.8mL/100mL。

5.如權利要求1所述的一種γ-亞麻酸的制備方法，其特征在于在步驟2）中，所述搖床培養的轉速為150～220rpm，搖床培養的溫度為28～30℃，搖床培養的時間為168～192h。

6.如權利要求1所述的一種γ-亞麻酸的制備方法，其特征在于在步驟3）中，所述發酵培養基的組成為葡萄糖10g/L；蔗糖70g/L；MgSO₄?0.2g/L；KH₂PO₄?2g/L；Yeast?Extract?2.5g/L；檸檬酸三鈉9.6g/L；檸檬酸2g/L；NH₄Cl?3g/L；玉米漿5g/L；吐溫80?0.5mL/50mL。

7.如權利要求1所述的一種γ-亞麻酸的制備方法，其特征在于在步驟3）中，所述搖瓶中培養的轉速為150～200rpm，培養的溫度為28～30℃，培養的時間為168～192h。

8.如權利要求1所述的一種γ-亞麻酸的制備方法，其特征在于在步驟4）中，所述清洗采用去離子水清洗3次。

9.如權利要求1所述的一種γ-亞麻酸的制備方法，其特征在于在步驟4）中，所述烘干的溫度為80℃，烘干的時間為24h。