[發明專利]與四環素結合的蛋白TetR在檢測四環素類抗生素中的應用

無效

• 申請號: 201210166652.3
• 申請日: 2012-05-25
• 公開（公告）號: CN102680711A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 徐飛;王戰輝;李向梅;趙寧;李娜;楊光
• 申請（專利權）人: 北京維德維康生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及與四環素結合的蛋白TetR在檢測四環素類抗生素中的應用。

背景技術

四環素類抗生素（tetracycline?antibiotics)是由放線菌產生的一類廣譜抗生素，包括金霉素（chlotetracycline)、土霉素（oxytetracycline）、四環素（tetracycline）及半合成衍生物甲烯土霉素、強力霉素、二甲胺基四環素等，其結構均含并四苯基本骨架。

四環素類抗生素具有如下應用：作為預防和治療畜禽疾病的獸藥，作為促進畜禽生長的飼料添加劑，在水產養殖業中用于治療多種魚類疾病，在乳業中用于提高奶牛產奶量，在養蜂業中用于預防蜜蜂的感染性疾病。四環素類抗生素過量使用不可避免的使母體、代謝產物等相關抗生素殘留于動物的肌肉、蛋、奶、臟器組織中，影響人體健康。

鑒于抗生素的作用與危害并存，動物性食品中四環素族抗生素的殘留問題受到關注，各國制定了動物源性食品中獸藥最高殘留標準和檢測方法。我國2002年農業部發布的235公告中規定土霉素/金霉素/四環素在所有動物性食品的肌肉中的含量不得高于100μg/kg，在牛奶及羊奶中的含量也不能超過100μg/kg。

發明內容

本發明的目的是提供與四環素結合的蛋白TetR（又稱TetR蛋白）在檢測四環素類抗生素中的應用。

本發明公開了TetR蛋白在檢測四環素類抗生素中的應用；所述TetR蛋白是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1自N末端第2至207位氨基酸殘基組成的蛋白質；

（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

（c）將（a）或（b）經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與四環素類抗生素結合的由（a）衍生的蛋白質。

所述TetR蛋白可用于制備檢測四環素類抗生素的試劑盒。

本發明還保護一種檢測四環素類抗生素的試劑盒，包括所述TetR蛋白（包被原）。

所述試劑盒還包括洗滌液、樣品稀釋液、底物顯色液和終止液中的至少一種。

每1升洗滌液可按照如下方法配制得到：將10ml吐溫20、5g疊氮化鈉和990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到洗滌液。所述磷酸鹽緩沖液可為pH7.2-7.6、0.005M-0.015M的磷酸鹽緩沖液，具體可為的濃度可為pH7.4、0.01M）的磷酸鈉緩沖液。

所述樣品稀釋液可為pH7.2、0.1M的PBS緩沖液。

所述底物顯色液包括顯色液A和顯色液B，可為獨立包裝的顯色液A和顯色液B，也可直接將顯色液A和顯色液B等體積混合得到。所述顯色液可為過氧化氫溶液或過氧化脲溶液；所述顯色液B可為鄰苯二胺（OPD）溶液或四甲基聯苯胺（TMB）溶液。所述顯色液A具體可為2％（g/100ml）過氧化脲水溶液。所述顯色液B具體可為1％（g/100ml）四甲基聯苯胺水溶液。

所述終止液具體可為0.2M硫酸水溶液。

所述TetR蛋白可用于制備檢測四環素類抗生素的試紙條。

本發明還保護一種檢測四環素類抗生素的試紙條，由樣品吸收墊、膠體金墊、反應膜和吸水墊組成；

沿試紙條的軸向，樣品吸收墊、膠體金墊、反應膜和吸水墊依次按順序連接，樣品吸收墊的末端與膠體金墊的始端相連，膠體金墊的末端與反應膜的始端相連，反應膜的末端與吸水墊的始端相連；

所述膠體金墊上包被有膠體金標記的N末端具有His標簽的所述TetR蛋白；

所述反應膜上有檢測區和質控區，檢測區（T線）和質控區（C線）均為與試紙條軸向垂直的條帶狀；檢測區位于靠近膠體金墊末端的一側；質控區位于遠離膠體金墊末端的一側；檢測區包被有包被原，質控區包被有His-tag單克隆抗體；所述包被原為四環素與載體蛋白的偶聯物；

所述試紙條上還可具有樣品孔，所述樣品孔位于樣本吸收墊上遠離膠體金墊末端的一端。

所述載體蛋白具體可為卵清白蛋白（OVA）。

以上任一所述TetR蛋白具體可為采用以下方法制備得到的蛋白質：培養重組菌，得到所述與四環素結合的蛋白TetR；所述培養過程中加入IPTG作為誘導劑；

所述重組菌為將重組質粒導入大腸桿菌得到的重組菌。所述重組表達載體具體可為在載體pET28b的多克隆位點插入所述與四環素結合的蛋白TetR的編碼基因得到的重組質粒。所述重組表達載體更具體可為在載體pET28b的NdeI和XhoI酶切位點之間插入所述編碼基因得到的重組質粒。