[發明專利]檢測白藜蘆醇在靶細胞定位的方法

有效

• 申請號: 201210165843.8
• 申請日: 2012-05-25
• 公開（公告）號: CN102680446A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 易龍;糜漫天;陳明亮;金鑫
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

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技術領域

本發明涉及檢測領域，特別涉及檢測白藜蘆醇在靶細胞定位的方法。

背景技術

白藜蘆醇是廣泛存在于葡萄、花生、虎杖、何首烏等多種天然食物和藥物中的植物化學物，具有顯著的降血脂、心血管保護、抗腫瘤、減肥、抗炎、抗衰老、保肝作用。美國已經上市了以白藜蘆醇為主要成分的多種保健食品或膳食補充劑，例如Longevity^TM抗衰老保健食品。以白藜蘆醇為先導化合物開發的抗腫瘤、抗心血管疾病、抗老年癡呆藥物也已成功篩選，部分藥物已進入臨床試驗，具有良好的應用前景。然而，白藜蘆醇多種生物學效應的分子機制尚未完全闡明，細胞內作用靶點也不明確，現有的研究證實與白藜蘆醇與細胞內多種大分子（蛋白質、核酸、糖蛋白等）的相互作用密切相關，相關分子機制有待進一步研究。因此，通過一定的技術手段明確白藜蘆醇在不同靶細胞的生物利用和亞細胞定位有助于闡明其作用靶點和作用機制。何卉等人報道了關于白藜蘆醇在腸道的吸收情況，利用高效液相色譜法測定不同時間白藜蘆醇在腸道中的濃度（何卉，陳西敬，王廣基等；藥物轉運體在反式白藜蘆醇腸道吸收中的作用．中國藥科大學學報．2008，39?(4)：324?–?328）。高欣等人研究了白藜蘆醇在體內的藥代動力學參數，包括血漿峰濃度、半衰期、尿液代謝物濃度等（高欣，謝文利，朱江等．納米級白藜蘆醇和白藜蘆醇β-環糊精包合物生物利用度的比較研究．中草藥，2011，42（5）：966-968）。Gester等人采用放射性核素（¹⁸F）或熒光探針標記白藜蘆醇的方法檢測其在腸道上皮的轉運特點（Gester?S，Wuest?F，Pawelke?B，Bergmann?R，Pietzsch?J.?Synthesis?and?biodistribution?of?an?18F-labelled?resveratrol?derivative?for?small?animal?positron?emission?tomography.?Amino?Acids.?2005?Dec；29(4)：415-28），這些方法可以用于檢測白藜蘆醇在腸道的吸收情況和跨膜轉運特點，但檢測周期長、標記費用高、存在人體放射危害，且常規實驗室不易開展。因此，急需一種檢測白藜蘆醇細胞內定位的方法，以進一步研究白藜蘆醇在不同靶細胞的作用靶點和作用機制。

發明內容

有鑒于此，本發明目的在于提供檢測白藜蘆醇在靶細胞定位的方法，其檢測方法簡單，檢測周期短，不存在放射危害。

為實現上述發明目的，技術方案為：

????檢測白藜蘆醇在靶細胞定位的方法，包括以下步驟：

a.?將靶細胞用濃度為1～40μM的白藜蘆醇處理，得白藜蘆醇處理靶細胞；

b.將步驟a所得白藜蘆醇處理靶細胞加入細胞器探針，得細胞器探針標記的靶細胞；

c.將步驟b所得細胞器探針標記的靶細胞在激光共聚焦顯微鏡觀察白藜蘆醇與細胞器探針的熒光位置，根據熒光重疊情況確定白藜蘆醇在靶細胞的定位。

優選的，所述步驟a是將靶細胞加入濃度為1～40μM白藜蘆醇中，在溫度為37℃、100%飽和濕度，體積分數為5%的CO₂培養箱培養至少1小時。

本發明中的方法可以用于檢測哺乳動物的任何細胞，優選的靶細胞為血管內皮細胞，肝細胞或腫瘤細胞。

本發明中使用的細胞器探針可以根據檢測的細胞器不同選擇細胞生物學上可接受的探針，優選的細胞器探針為細胞膜熒光探針、線粒體熒光探針或細胞核熒光探針。更優選的，所述細胞膜熒光探針為細胞膜紅色熒光探針（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine?perchlorate，Dil探針），所述線粒體熒光探針為線粒體膜電位熒光探針（5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine?iodide?5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolocarbocyanine?iodide?CBIC2(3)，JC-1），所述細胞核熒光探針為標記細胞DNA的熒光探針（Propidium?Iodide，PI）。

優選的，所述步驟c中白藜蘆醇激發波長為322nm，接收波長為350～500nm條件下檢測。

更優選的，所述接收波長為405nm。