[發明專利]一種細菌傳遞的非注射型DNA疫苗

無效

• 申請號: 201210165259.2
• 申請日: 2012-05-25
• 公開（公告）號: CN102698288A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 孫黎;孫云;胡永華
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/09;A61K39/02;A61P31/04
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及基因工程和疫苗學領域，具體的說是一種細菌傳遞的非注射型DNA疫苗。

背景技術

DNA疫苗也稱為核酸疫苗或基因疫苗。這種疫苗是將編碼病原的某種抗原基因克隆于一個真核表達載體，由此獲得重組表達質粒，即DNA疫苗。DNA疫苗注射到所要免疫的動物體內后，其攜帶的抗原基因即可在動物體內表達，由此產生的抗原即可誘發機體的免疫反應，使得受免動物獲得特定的免疫保護。DNA疫苗的優點是安全，并且免疫效應較好，因此是一種具良好發展潛力的疫苗形式。然而，由于DNA疫苗的導入方式通常是注射，因此在應用上具有注射型疫苗的所有局限。如何既保持DNA疫苗的優點又克服其注射應用的缺點是一個需要解決的問題。

遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella?tarda)和海豚鏈球菌(Streptococcus?iniae)是重要的水產養殖病原菌。這兩種細菌皆能感染多種海水和淡水魚類，包括我國重要的經濟品種牙鲆和大菱鲆，從而給養殖業造成嚴重的經濟損失。

發明內容

本發明目的在于提供一種細菌傳遞的非注射型DNA疫苗。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種細菌傳遞的非注射型DNA疫苗，以遲緩愛德華氏菌減毒株TX5RM作為傳遞載體，傳遞海豚鏈球菌DNA疫苗pCNSi10菌株的細菌傳遞的非注射型DNA疫苗。

所述細菌傳遞的非注射型DNA疫苗為將海豚鏈球菌DNA疫苗pCNSi10菌株轉化入遲緩愛德華氏菌減毒株TX5RM中，得DNA疫苗菌株TX5Si。

所述DNA疫苗菌株TX5Si可作為制備遲緩愛德華氏菌和/或海豚鏈球菌的DNA疫苗。

本發明具有如下優點：

1.制備簡單。本發明的疫苗只需簡單的常規細菌培養，無需任何提取、純化過程。

2.非注射型應用。本發明的疫苗具有減毒疫苗和DNA疫苗的共同優點，可以通過浸泡和口服方法導入，從而避免了常規的注射型DNA疫苗的缺點。

3.交叉保護效應。本發明疫苗能夠同時保護魚類抵抗遲緩愛德華氏菌和海豚鏈球菌感染。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。

實施例1

非注射型DNA疫苗的構建

步驟1)海豚鏈球菌DNA疫苗pCNSi10的構建：以質粒pACYC184(購于北京New?England?Biolabs公司)為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增，PCR條件為：94℃60s預變性模板DNA，然后94℃40s，55℃60s，72℃60s，5個循環后改為94℃40s，63℃60s，72℃60s，25個循環后再在72℃延伸反應10min。PCR產物用“天根生化科技(北京)有限公司”DNA產物純化試劑盒純化。PCR產物純化后與載體pBS-T(購于“天根生化科技(北京)有限公司”)于室溫連接4-6小時，連接混合液轉化大腸桿菌DH5α，在含有氨芐青霉素(100ug/ml)的LB培養基上培養，篩選轉化子提取質粒，即為質粒pBSSi。將質粒pBSSi和質粒pSia10(pSia10構建見參考文獻Cheng?S，Hu?Y，Jiao?X，Sun?L.Identification?and?immunoprotective?analysis?of?a?Streptococcus?iniae?subunit?vaccine?candidate.Vaccine?2010；28：2636-41)用限制性內切酶BamHI酶切，分別回收0.9kb和6kb片段，將這二片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌DH5α，在含有氨芐青霉素(100ug/ml)的LB培養基上培養，篩選轉化子提取質粒，即為質粒pCNSi10。

所述LB組成成分按重量百分比計：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化鈉，97.5％蒸餾水；

所述引物為F1：5’-ATGGATCCAGGAGGGACAGCTGATA-3’和Ri：5’-GGATCCGAATGCACCAATAACTGCCT-3’。