[發明專利]只加入rmGM-CSF誘導BALB/c小鼠骨髓細胞分化為未成熟樹突細胞的方法

無效

• 申請號: 201210165252.0
• 申請日: 2012-05-25
• 公開（公告）號: CN103421741A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 高曉明;李躍;洪超;張巖;徐曉軍
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明是關于一種誘導得到未成熟樹突細胞的方法，具體是在只加入rmGM-CSF的情況下從BALB/c小鼠骨髓細胞成功誘導分化得到未成熟樹突細胞的方法，意義在于在此基礎上可以用原核表達純化的鈣網蛋白誘導其成熟，對樹突細胞介導的腫瘤治療具有潛在的應用價值。

背景技術

2011年度諾貝爾生理學或醫學獎授予了三位免疫學家，其中加拿大人拉爾夫·斯坦曼(Ralph?M.Steinman)對獲得性免疫中樹突細胞(dendritic?cells，DC)的研究得到了首肯。1973年，斯坦曼等人首次從小鼠脾臟中分離出一類白細胞，因其細胞膜向外伸出，形成類似神經細胞的樹狀突起，而命名為樹突細胞。樹突細胞在抗原俘獲、加工和遞呈過程中都發揮著關鍵性的作用，可輔助其他免疫細胞更好地發揮功能。樹突細胞的發現及生理功能研究為許多疾病如癌癥、AIDS、自身免疫性疾病等治療帶來了美好前景，斯坦曼也因此成為免疫學領域的科學大師之一。20世紀80年代，Inaba在體外成功地培養和擴增了小鼠樹突細胞，90年代初，Caux和Banchereau誘導和擴增出了人樹突細胞。

DC作為目前發現的抗原提呈功能最強的細胞，在免疫應答反應中起著舉足輕重的作用。DC源于骨髓多潛能干細胞，從干細胞發育到祖細胞，再到前體細胞，最后進入血液循環，循環的DC通過血管細胞間隙進入組織后成為未成熟DC。它分布于全身的各臟器，在外周血中數量極少，僅占外周血白細胞數量的1％，但卻發揮著至關重要的作用。實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型大腦中分離出大量表型為CD11b+CD11c+DC，能促進調節性T細胞的增殖，抑制免疫應答，突破了人們認為腦中沒有DC分布的觀點，使DC的分布范圍擴展到了全身。DC有諸多亞群，其形態和功能各不相同，與其來源、成熟狀態和組織定位等有關。DC按來源可分為髓系DC和漿系DC；按成熟狀態可分為未成熟樹突細胞(immatured?dendritic?cell，imDC)和成熟樹突細胞(matured?dendritic?cell，mDC)；按組織定位則分為淋巴組織固有DC、外周組織DC和循環系統DC，其中，外周組織DC主要分布于皮膚和黏膜組織。皮內DC包括朗格漢斯細胞(Langerhans?cell，LC)和真皮內DC。2007年發表于《科學》雜志的一項研究表明，DC和巨噬細胞具有共同的前體干細胞，這種干細胞能夠分化為兩類細胞，一類為巨噬細胞和DC前體細胞，分化為單核巨噬細胞和少量DC；另一類為普通DC前體細胞，最終分化為各種亞群的DC細胞。

腫瘤疫苗的研究長期以來一直是腫瘤特異性主動免疫治療的主要研究方向，近年來，隨著對腫瘤抗原攝取、加工、提呈以及T淋巴細胞活化機理等方面的認識不斷深入，有關腫瘤疫苗的研究十分活躍，其中樹突細胞瘤苗以其設計的合理性，應用的可操作性及顯著的初步臨床應用效果而備受矚目。在1999年4月美國痛癥年會上樹突細胞瘤苗被認為是腫瘤治療的一種最有希望的新技術。DC作為目前發現的功能最強的抗原遞呈細胞(APC)，能夠誘導特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)生成，應用腫瘤相關抗原或抗原多肽體外沖擊致敏DC，回輸或免疫接種于載瘤宿主，通過MHC1抗原分子遞呈給CD8+細胞毒性T細胞，從而誘發特異性CTL的抗腫瘤免疫反應。DC根據其表面標記及抗原提呈功能分為未成熟DC及成熟DC。未成熟DC位于抗原入侵的部位，具有捕獲、處理抗原的能力，但缺乏激活T細胞的能力。在種種刺激因子刺激下轉化為具有抗原提呈功能，且表面表達共刺激分子的成熟DC。DC也是體內重要的免疫調節細胞，可通過分泌不同的細胞因子參與固有和適應性免疫應答。

因此，有效并且快速大量的誘導得到未成熟DC是樹突細胞瘤苗的基礎，本實驗方法在只加入rmGM-CSF的情況下從BALB/c小鼠骨髓細胞就可以成功誘導分化得到未成熟樹突細胞，方法簡單易操作，得到的未成熟DC純度高，并且可以在此基礎上用原核表達純化的鈣網蛋白誘導其成熟，對樹突細胞介導的腫瘤治療具有潛在的應用價值。

經查，未發現只加入rmGM-CSF誘導BALB/c小鼠骨髓細胞分化為未成熟樹突細胞的方法的報道。

發明內容

本發明的目的主要在于簡單快捷地誘導出高產量高純度的未成熟DC，為樹突細胞介導的腫瘤治療打下堅實的基礎。