[發明專利]一種重組質粒及其制備的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白亞單位疫苗

無效

• 申請號: 201210164228.5
• 申請日: 2012-05-24
• 公開（公告）號: CN102719466A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 姚火春;吳蕾;蔣亞楠;潘子豪
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N1/21;C12N5/10;C12N9/52;A61K39/02;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種重組質粒及其制備的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白亞單位疫苗。?

背景技術

基因克隆技術已有40多年的良好應用，它包括把來自不同生物的基因同有自主復制能力的載體DNA在體外人工連接，構建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達，從而產生遺傳物質和狀態的轉移和重新組合。?

亞單位疫苗具有許多特點：（1）亞單位疫苗較穩定、費用低、容易進行生產和使用；（2）是一類新型疫苗，是將致病菌主要的保護性免疫原存在的組分制成的疫苗。（3）去除病原體中與激發保護性免疫無關甚或有害的成分，有效地增強了疫苗的免疫原性并且減少了副作用。?

嗜水氣單胞菌(Ah)是我國水產養殖業的重要威脅之一，它是人、畜及水生動物共患的條件致病菌。該菌廣泛存在于水環境中，是多種水產動物的主要致病菌，亦可引發人類的腹瀉或敗血癥等，對食物安全具有威脅，并且是抑制病人免疫系統功能和肝功能。該菌的致病性與其眾多的毒力因子密切相關，其中胞外蛋白酶為最常見的毒力因子之一，它具有吞噬作用，能夠刺激機體產生特異性抗體，與Ah的致病性和機體的免疫保護作用密切相關，一直是研究嗜水氣單胞菌疫苗的焦點。而利用Ah的毒力基因胞外蛋白酶制備的重組亞單位疫苗，目前尚無相關報道。?

發明內容

本發明的目的是研制一種能夠有效控制嗜水氣單胞菌感染的重組亞單位疫苗，可為嗜水氣單胞菌的防控提供有力的支持。?

本發明的目的可通過如下技術方案實現：?

一種重組質粒pET32a-epr2-3，該重組質粒以pET32a為出發質粒，其Kpn?I和EcoR?I酶切位點之間插入嗜水氣單胞菌的epr3基因，EcoR?I和Sal?I酶切位點間插入嗜水氣單胞菌的epr2基因，其中所述的epr3基因GenBank登錄號為EU275147.1，epr2基因GenBank登錄號?為CP000462.1。?

所述的重組質粒pET32a-epr2-3優選通過如下方法制備得到：?

（1）epr2和epr3基因的克隆：以保藏號為CGMCC?NO.3220的嗜水氣單胞菌J-1株的DNA為模板，分別以引物Epr2-1/Epr2-2及引物Epr3-1/Epr3-2通過PCR擴增，得到epr2基因和epr3基因，將其分別插入pMD-18T質粒，得到pMD-18T-epr2和pMD-18T-epr3；?

（2）重組質粒pET32a-epr3的構建：利用Kpn?I和EcoR?I對pMD-18T-epr3和pET32a分別進行雙酶切，將獲得的epr3基因酶切產物插入pET32a的Kpn?I和EcoR?I酶切位點之間，得到重組質粒pET32a-epr3；?

(3)重組質粒pET32a-epr2-3的構建：利用EcoR?I和Sal?I對pMD-18T-epr2和pET32a-epr3分別進行雙酶切，將酶切產物epr2基因插入重組質粒pET32a-epr3的EcoR?I和Sal?I酶切位點間，得到重組質粒pET32a-epr2-3。?

含有所述的重組質粒pET32a-epr2-3的宿主。?

所述的宿主優選細菌或細胞，進一步優選大腸桿菌BL21。?

一種嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白Epr2-3，所述的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白由所述的含有重組質粒pET32a-epr2-3的重組大腸桿菌BL21所分泌。?

所述的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白Epr2-3，優選將含有重組質粒pET32a-epr2-3的重組大腸桿菌BL21接種于LB培養基中，振蕩培養后加入0.1M?IPTG誘導蛋白表達，繼續培養后離心獲得菌體，超聲破碎后離心獲得上清和包涵體，對包涵體進行變性溶解，再分別取兩者以His親和層析柱純化重組蛋白，收集所得即為重組蛋白Epr2-3。?

所述的重組質粒pET32a-epr2-3在制備嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白亞單位疫苗中的應用。?

所述的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白Epr2-3在制備嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白亞單位疫苗中的應用。?

一種嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白亞單位疫苗，含有所述的嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶重組蛋白Epr2-3及佐劑。?

所述的佐劑優選弗氏完全佐劑或DC-Chol佐劑。?

有益效果：?