[發明專利]一種陽離子聚合物基因載體及制備方法

無效

• 申請號: 201210163941.8
• 申請日: 2012-05-23
• 公開（公告）號: CN102690843A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 邢金峰;張彪;王重夕;鄧聯東;董岸杰
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C08F271/02
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明屬于生物材料技術領域，涉及一種新型陽離子聚合物基因載體的合成。

背景技術

基因治療是一種將外源基因導入目的細胞并有效表達，從而達到治病目的的治療方法。裸露的外源基因DNA帶負電，難以滲入同樣帶負電的細胞膜且容易被機體或細胞降解，因而難以表達。所以基因治療的關鍵是選擇合適的基因載體及基因導入方法，使目的基因能夠在靶細胞中獲得安全、高效、可控且穩定的表達。

基因載體主要有病毒載體和非病毒載體兩類。1.病毒載體轉染效率高，但也有能誘導宿主免疫反應、潛在的致瘤性、裝載容量有限、代價高等缺點，限制了它們的應用。2.非病毒載體是目前公認可替代病毒載體的基因載體系統，它可避免諸如免疫原性、毒性等病毒載體的缺陷。具有低毒、低免疫反應，外源基因隨機整合率低且攜帶基因大小類型不受限制等優點。雖然非病毒載體安全性好，但存在轉染、整合效率低等缺點。

因此，如何研制出安全有效的、生物相容性好的基因藥物載體，如何提高非病毒性基因載體的靶向特異性和體內外轉染效率，已經是迫在眉睫的關鍵問題。

陽離子聚合物載體是一種非病毒性基因載體。它是利用帶正電的高聚物靜電結合濃縮DNA，再通過靜電作用結合細胞膜或通過攜帶的靶向配體與細胞膜上的帶負電荷的受體結合，通過內吞、逃離內體和胞質轉運的方式，使DNA進入細胞核，從而表達目的基因。

聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(Poly(2-(dimethylamino)ethyl?methacrylate),PDMAEMA)是一種具有溫度和pH敏感性的高分子，在中性或酸性條件下具有很好地結合DNA的能力。PDMAEMA分子結構中同時具有親水性的叔胺基、羰基和疏水性的烷基基團，且兩類基團在空間結構上互相匹配，當環境改變時會造成氫鍵的形成與破壞，從而導致高分子相態的變化。類似于聚乙烯亞胺（PEI）,PDMAEMA在生物體內不可降解，高相對分子質量(通常>3萬)的PDMAEMA已無法通過腎臟排出，在使用高相對分子質量PDMAEMA作為載體時，會不可避免在體內殘留。借鑒改性PEI的方法，低相對分子質量的PDMAEMA可通過體內可斷裂的化學鍵連接起來形成高相對分子質量的PDMAEMA衍生物。

聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)是一種水溶性酰胺類高分子聚合物，PVP具有很多優良的特性，如優良的溶解性、增溶性、成膜性、絡合性、黏接性及一定的表面活性，特別是具有良好的生理相容性，因而使其在醫藥領域中廣泛應用。PVP優良的生理惰性，不參與人體新陳代謝．又具有優良的生物相容性，對皮膚、粘膜、眼等不形成任何刺激。

PVP尤其指PVP水凝膠和PVP與其他聚合物共混或共聚的水凝膠，由于其良好的生理相容性，在醫藥領域有著廣泛的應用,說明了它具有作為基因載體輔料的潛在能力。

發明內容

本發明的目的在于降低現有的聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯的細胞毒性，提供一種轉染效率高，細胞毒性小的陽離子聚合物基因載體。

本發明的第二個目的是提供一種陽離子聚合物基因載體的制備方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種陽離子聚合物基因載體，是由主鏈聚乙烯吡咯烷酮和支鏈聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯接枝而成，所述接枝的聚合物含有8.8%-40%的接枝度。

所述聚乙烯吡咯烷酮的相對分子量為10000~60000。

所述每條支鏈聚甲基丙烯酸N,N二甲氨基乙酯的分子量為1000~4000。

陽離子聚合物基因載體的制備方法，包括以下步驟：

(1)按質量比1:5～20將聚乙烯吡咯烷酮溶于雙蒸水中，攪拌1～2h溶解形成水凝膠，按水凝膠與四氯化碳體積比1:2～3加入四氯化碳，攪拌使所述水凝膠分散于四氯化碳中；按N-溴代琥珀亞酰胺與聚乙烯吡咯烷酮質量比為1.6～3:1的比例加入N-溴代琥珀亞酰胺，再按聚乙烯吡咯烷酮與偶氮二異丁腈質量比為1:0.014～0.03加入偶氮二異丁腈，于85-95℃回流反應20～60h；除去四氯化碳有機相，將剩余水相用截止分子量3500~10000的透析袋透析2～5天；產物冷凍干燥后得到大分子引發劑溴化聚乙烯吡咯烷酮，所述溴化聚乙烯吡咯烷酮用PVP-Br表示；