[發(fā)明專利]一種提高丙酮丁醇梭菌在混合糖發(fā)酵中糖利用率的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210163123.8
• 申請(qǐng)日: 2012-05-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102796692A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顧陽(yáng);肖晗;姜衛(wèi)紅;寧媛媛;李治林;蔣宇;孫喆;楊晟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12P7/06;C12P7/16;C12P7/28;C12R1/145
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 楊昀

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)和發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種提高丙酮丁醇梭菌(Clostridium?acetobutylicum)在混合糖發(fā)酵中糖利用率(尤其是木糖和阿拉伯糖的利用率)的方法、用于該方法中的菌株、其用途及制備方法。

背景技術(shù)

丁醇是具有多種用途的大宗基礎(chǔ)原料，在染料、油漆、塑料、樹(shù)脂、橡膠等化學(xué)化工領(lǐng)域中，可用作多種有機(jī)化合物合成的前體；為抗生素及合成藥生產(chǎn)過(guò)程中必不可少的溶媒；同時(shí)也是食品、香料工業(yè)的食品級(jí)抽提劑。另一方面，丁醇尚是一種辛烷值高于汽油的優(yōu)質(zhì)燃料和燃料添加劑，其高沸點(diǎn)(118℃)和低蒸汽壓有助于汽車的冷啟動(dòng)；并且，由于丁醇的疏水性比乙醇更強(qiáng)，其更易于與汽、柴油烴類燃料相混溶；此外，丁醇的完全燃燒性，可大大降低尾氣的CO₂排放，且不發(fā)生殘留烴污染，對(duì)凈化空氣十分有利。顯然，上述優(yōu)點(diǎn)有可能使丁醇成為未來(lái)發(fā)動(dòng)機(jī)的新型綠色燃料，替代礦化燃料成為可持續(xù)發(fā)展的再生能源之一，在未來(lái)的運(yùn)輸燃料結(jié)構(gòu)中將會(huì)占有重要的比重。

我國(guó)傳統(tǒng)的丁醇發(fā)酵生產(chǎn)中采用的生產(chǎn)菌丙酮丁醇梭菌(Clostridium?acetobutylicum)是以糧食原料(如玉米、小麥等)為底物的。較高的糧食價(jià)格致使原料費(fèi)用占溶劑生產(chǎn)總成本的比例偏高(75%以上)，這不僅限制了丁醇產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，也嚴(yán)重違背了我國(guó)的糧食安全戰(zhàn)略。因此，就長(zhǎng)遠(yuǎn)而言，以非糧原料，尤其是廉價(jià)的木質(zhì)纖維素資源(如秸稈、稻草等)通過(guò)生物轉(zhuǎn)化制造丁醇是今后發(fā)展的必然趨勢(shì)。

丙酮丁醇梭菌除了能夠利用葡萄糖、蔗糖、淀粉外，還能利用木糖、乳糖、阿拉伯糖等多種碳源。農(nóng)林廢棄物(秸稈、稻草等)中的纖維素和半纖維素水解后的主要成分是葡萄糖、木糖及阿拉伯糖，丙酮丁醇梭菌寬泛的底物譜使得該菌可以利用纖維素、半纖維素水解液為原料進(jìn)行生物丁醇的發(fā)酵。纖維素和半纖維素在自然界中占到植物界碳素的50%以上，利用纖維素和半纖維素水解液進(jìn)行生物丁醇發(fā)酵，有望大大降低原料成本。

然而，丙酮丁醇梭菌與很多其它細(xì)菌一樣存在著糖代謝物阻遏效應(yīng)(carbon?catabolite?repression，CCR)，即在葡萄糖存在時(shí)，幾乎不利用木糖和阿拉伯糖。此外，丙酮丁醇梭菌木糖代謝本身也存在瓶頸。鑒于此，提高丙酮丁醇梭菌在混合糖中木糖和阿拉伯糖利用率需要克服兩個(gè)問(wèn)題，一是葡萄糖存在時(shí)對(duì)木糖、阿拉伯糖代謝的阻遏，二是木糖代謝自身存在的瓶頸。

PTS系統(tǒng)(磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，phosphoenolpyruvate?-carbohydrate?phosphotransferase?system)是產(chǎn)溶劑梭菌轉(zhuǎn)運(yùn)六碳糖的主要系統(tǒng)，它轉(zhuǎn)運(yùn)碳水化合物進(jìn)入胞內(nèi)的同時(shí)伴隨底物的磷酸化。典型的PTS系統(tǒng)包含磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、HPr(組氨酸-可磷酸化蛋白，histidine-phosphorylatable?protein)和三個(gè)催化實(shí)體，分別是酶I、酶II和酶III。酶II組分的Glc(葡萄糖-葡糖苷，glucose-glucoside)蛋白或Man(甘露糖-果糖-山梨糖，mannose-fructose?-sorbose)蛋白可調(diào)節(jié)葡萄糖PTS的活性，在丙酮丁醇梭菌中已證明是Glc家族蛋白對(duì)葡萄糖的磷酸化起關(guān)鍵作用，其中的基因glcG已在生物信息學(xué)水平被預(yù)測(cè)。

然而，研究者在針對(duì)多種細(xì)菌(例如枯草桿菌、大腸桿菌、鏈霉菌)的研究中發(fā)現(xiàn)敲除PTS系統(tǒng)都會(huì)導(dǎo)致葡萄糖利用延遲甚至不用，進(jìn)而降低葡萄糖的生產(chǎn)效率和轉(zhuǎn)化率，因此認(rèn)為該系統(tǒng)并不適于用作改造靶點(diǎn)(Eiteman,M.A.,S.A.Lee等(2008).J?Biol?Eng2:3.；Paulsen，I.T.，S.Chauvaux，等(1998).J?Bacteriol?180(3):498-504.；Perez-Redondo,R.，I.Santamarta等(2010)，Microbiology?156(Pt?5):31527-1537.)。