[發(fā)明專利]一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細(xì)胞的方法及試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210159496.8
• 申請日: 2012-05-21
• 公開（公告）號(hào): CN102643926A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 班付國;高延玲;張發(fā)旺;劉宏偉;周紅霞;黃京燕;馬俊;韓立;高小玲;焦玉萍;朱松波;宋志超;舒暢;李華岑;李金磊;董鵬;陳曉鴿;賈振民
• 申請（專利權(quán)）人: 河南省獸藥監(jiān)察所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/10
• 代理公司: 鄭州紅元帥專利代理事務(wù)所(普通合伙) 41117
• 代理人: 王瑞麗

1.一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細(xì)胞的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括以下成分：沙門氏菌陽性對(duì)照、沙門氏菌陰性對(duì)照、Taq預(yù)混酶及引物混合物、DL?Marker?2000、EMA溶液和共價(jià)交聯(lián)曝光裝置。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細(xì)胞的試劑盒，其特征在于：所述Taq預(yù)混酶及引物混合物中，預(yù)混酶濃度為20u/mL，引物濃度為100pmol/mL，其保存條件為-20°C。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細(xì)胞的試劑盒，其特征在于：所述引物的序列為：SE-1：GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG；SE-2:?CATCGCACCGTCAAAGGAAC。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細(xì)胞的試劑盒，其特征在于：疊氮溴化已啶濃度為0.5mg/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細(xì)胞的試劑盒，其特征在于：所述共價(jià)交聯(lián)曝光裝置包括箱體，所述箱體上設(shè)有活動(dòng)門、鹵素?zé)糸_關(guān)、紫外燈管開關(guān)和總電源開關(guān)，所述箱體內(nèi)頂部設(shè)有鹵素?zé)簦潴w兩側(cè)內(nèi)壁上分別設(shè)置有至少一個(gè)紫外燈管。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細(xì)胞的試劑盒，其特征在于：所述的紫外燈管為兩個(gè)。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細(xì)胞的試劑盒，其特征在于：所述箱體上還設(shè)有可視窗口。

8.一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細(xì)胞的方法，其特征在于：包括如下步驟：?

1）將飼料樣品用BPW肉湯增菌，分別吸取500ul菌懸液于四個(gè)1.5mL離心管中，其中兩份作為制備好的活細(xì)胞菌懸液，兩份進(jìn)行100°C水浴10?min制成死細(xì)胞懸浮液；

取活細(xì)胞菌懸液及死細(xì)胞菌懸液各一份，分別加入4ul?0.5mg/mL的疊氮溴化已啶溶液，搖勻，將其置于冰盒上，在共價(jià)交聯(lián)裝置內(nèi)曝光3min；

2）對(duì)四支離心管內(nèi)的菌懸液分別提取細(xì)菌DNA；

3）PCR擴(kuò)增沙門氏菌invA基因：取試劑盒中預(yù)混酶及引物混合物，50ul體系吸取40ul，加入提取的細(xì)菌DNA10?ul進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30sec，56℃退火30?sec，72℃延伸45sec，33個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸10?min；

4）電泳分析：將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析。