[發明專利]一種分析微藻磷脂組的方法

無效

• 申請號: 201210159133.4
• 申請日: 2012-05-21
• 公開（公告）號: CN102680630A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 元英進;陸姝歡;楊潔;牛艷紅;馬倩
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種分析微藻磷脂組的方法，其特征是包括如下步驟：

（1）微藻細胞收集及淬滅：

取出已培養好的微藻藻液樣品3-5份，每份100-150mL，在3000-5000rpm，4℃條件下離心3-4min，收集下層的細胞，加入3-5mL代謝終止液，在-40℃下淬滅5-10min，在-80℃下冷凍干燥4-6h獲得凍干細胞；所述代謝終止液為：1500mM?NaNO₃，36mM?CaCl₂·2H₂O，75mMMgSO₄·7H₂O和40mM?K₂HPO₄·3H₂O，余量為甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的體積比為1:2；

（2）提取細胞內磷脂：

從3-5份凍干細胞中各取15-25mg，分別置于離心管中，每管加入0.75-1.5mL氯仿及0.3-0.6mL超純水，100-150rpm震蕩1-1.5h；再加入2-4mL磷脂提取液，室溫下以100-150rpm震蕩0.5-1h，收集氯仿相；向殘渣中加入2-4mL磷脂提取液，室溫下以100-150rpm震蕩0.5-1h，收集氯仿相；反復提取3次，將氯仿相合并，向合并的氯仿相中加入0.5-1mL?1M?KCl水溶液，渦旋0.5-1min，以3000-4000rpm離心3-5min，棄水相，再加入1-2mL超純水，渦旋0.5-1min，以3000-4000rpm離心3-5min，棄水相，30-35℃真空干燥得干物質；溶于磷脂存儲液中置于-40℃保存；

所述磷脂提取液為質量百分比為0.05-0.15%的二丁基羥基甲苯的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液中氯仿的體積百分含量為66.7%；所述磷脂存儲液為質量百分比為0.05-0.15%的二丁基羥基甲苯的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液中氯仿的體積百分含量為50%；

（3）LC-MS檢測

采用LC-MS對步驟（2）獲得的保存于磷脂存儲液中的磷脂樣品進行定性和定量處理，條件如下：

色譜柱：Venusil?XBP硅柱，其規格為150mm×2.1mm?i.d.，5μm；

進樣量：5μL；

色譜柱內流速：0.2mL·min^-1；

柱溫：25°C；

流動相配比：流動相A：體積比為89.5/10/0.5的氯仿/甲醇/28%氫氧化銨；流動相B：體積比為55/39/5.5/0.5的氯仿/甲醇/水/28%氫氧化銨；得到磷脂樣品中的磷脂譜，所述28%氫氧化銨為質量濃度為28%的氫氧化銨水溶液；

流動相線性梯度程序：從開始到第7分鐘，流動相A的體積百分比由90%下降到77%；維持77%到第10分鐘；從第10分鐘到第15分鐘，流動相A的體積百分比由77%下降到72%；從第15分鐘到第20分鐘，流動相A的體積百分比由72%下降到66%；從第20分鐘到第25分鐘，流動相A的體積百分比從66%下降到60%；從第25分鐘到第45分鐘，流動相A的體積百分比從60%下降到50%；維持50%到第50分鐘；從第50分鐘到第60分鐘，流動相A的體積百分比從50%上升到90%；維持90%到第70分鐘。