[發(fā)明專(zhuān)利]重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo t 5蛋白及其制備方法與用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210157336.X
• 申請(qǐng)日: 2012-05-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103421106A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡俊龍;楊彬;付永鋒;程訓(xùn)佳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/435
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/435;C12N15/12;C12N15/70;G01N33/68;A61K39/35;A61P33/14
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo?t5蛋白及其制備方法與用途?

背景技術(shù)

過(guò)敏性哮喘是危害嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，近年來(lái)，其發(fā)病率及死亡率呈持續(xù)上升趨勢(shì)。據(jù)WHO估計(jì)，全世界現(xiàn)有3億的哮喘患者，其中50％以上的成人和至少80％的兒童患者均由過(guò)敏因素誘發(fā)，每年有25萬(wàn)以上的患者死于哮喘，因此，哮喘已不僅是發(fā)達(dá)國(guó)家的公共衛(wèi)生問(wèn)題，幾乎所有國(guó)家都深受其害。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)大陸哮喘的發(fā)病率尚較低，為2.1%(不包括香港6.2%和臺(tái)灣2.6%)，但我國(guó)哮喘患者的死亡率卻高達(dá)36.7/10萬(wàn)，位居全球第一。此外，我國(guó)哮喘的發(fā)病在各地區(qū)之間的差異可達(dá)10倍，以重慶最高，西藏最低，并且在未來(lái)十年內(nèi)，哮喘的發(fā)病將持續(xù)上升，由于我國(guó)人口基數(shù)大，哮喘的發(fā)病率上升2個(gè)百分點(diǎn)，將增加2千萬(wàn)以上的發(fā)病人數(shù)。?

研究表明，過(guò)敏性哮喘可以由多種因素誘發(fā)，其中環(huán)境中存在的各種變應(yīng)原是其主要誘發(fā)原因。這些變應(yīng)原包括塵螨、動(dòng)物的皮屑、花粉和霉菌等，在眾多的變應(yīng)原中螨類(lèi)是最主要的變應(yīng)原，花粉、真菌次之。螨變應(yīng)原是引起變態(tài)反應(yīng)性疾病的重要病因之一，也是引起兒童變應(yīng)性哮喘的獨(dú)立且重要的危險(xiǎn)因子。塵螨主要包括戶(hù)塵螨、粉塵螨和熱帶剝爪螨。生物學(xué)研究表明，環(huán)境溫度和濕度是影響螨類(lèi)生存的主要因素，戶(hù)塵螨、粉塵螨和熱帶剝爪螨的分布具有明顯的地域性。其中在熱帶和亞熱帶地區(qū)熱帶剝爪螨為主要的螨種。?

近年來(lái)，有研究通過(guò)免疫印跡方法從熱帶剝爪螨中分離鑒別出至少25種變應(yīng)原。已正式命名的有Blo?t1、Blo?t3、Blo?t4、Blo?t5、Blo?t6、Blo?t10、Blo?t11、Blo?t12、Blo?t13、Blo?t19和Blo?t21等11種。剝爪螨變應(yīng)原Blo?t5是熱帶剝爪螨的主要變應(yīng)原蛋白，可被大部分熱帶剝爪螨過(guò)敏患者血清中的IgE抗體特異性結(jié)合。核磁共振的方法研究Blo?t5的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)?它的空間結(jié)構(gòu)有兩個(gè)很靠近的表位，分別有完整的抗體互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determining?regions，CDRs），有很好的抗原抗體結(jié)合性。?

目前臨床上對(duì)熱帶剝爪螨過(guò)敏患者的診斷和特異性抗原免疫治療采用的是傳統(tǒng)的熱帶剝爪螨浸出液，其含有多種抗原成分，且相對(duì)效價(jià)和特異性抗原水平存在明顯的差異，很難進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定量，容易引起患者出現(xiàn)診斷或治療性過(guò)敏反應(yīng)，因此對(duì)其診治的應(yīng)用受到限制。本申請(qǐng)發(fā)明人關(guān)注到，重組的熱帶剝爪螨變應(yīng)原蛋白不僅產(chǎn)量高，生產(chǎn)條件恒定，將有利于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，更適合進(jìn)行臨床診斷與治療。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的熱帶剝爪螨變應(yīng)原浸出液進(jìn)行過(guò)敏性疾病的診斷與治療的存在的不足，提供重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo?t5蛋白及其制備方法與用途。?

本發(fā)明通過(guò)基因工程手段，從克隆化培養(yǎng)的熱帶剝爪螨提取其主要變應(yīng)原蛋白Blo?t5的編碼基因，構(gòu)建表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo?t5，獲得的重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo?t5蛋白可用于熱帶剝爪螨引起的過(guò)敏性疾病的診斷與治療。?

本發(fā)明的重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo?t5蛋白是由序列SEQ?ID?No：1核苷酸序列編碼的蛋白；Blo?t5編碼基因所編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?No：2所示。?

本發(fā)明提供了一種用于制備重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo?t5蛋白的質(zhì)粒，然而產(chǎn)生本發(fā)明的質(zhì)粒構(gòu)建方法不受特別的限制。?

本發(fā)明提供了重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo?t5的制備方法，其包括如下步驟：?

（1）熱帶剝爪螨的克隆化培養(yǎng)培養(yǎng)；?

（2）從上述克隆化培養(yǎng)的熱帶剝爪螨的菌體中提取總RNA；?

（3）合成引物：?

Blo?t5-S5-CCCATATGAAGAAGGATGATTTCCGAA-3?

Blo?t5-as5-CCCTCGAGTTATTGGGTTTGAATATC-3?

（4）以cDNA為模板，通過(guò)PCR獲得熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo?t5編碼基因片段；?

（5）將編碼基因克隆入原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化宿主菌，培養(yǎng)所得重組工程菌，?然后誘導(dǎo)其表達(dá)目的蛋白；?

（6）采用Ni²⁺親和層析將重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo?t5提純，從而獲得純化的重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo?t5；?

（7）免疫學(xué)方法鑒定重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo?t5免疫原性?