[發明專利]血小板形態掃描成像和血小板活化功能評估的方法

有效

• 申請號: 201210156850.1
• 申請日: 2012-05-18
• 公開（公告）號: CN102662088A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 張彥軍;張建寧;董京飛
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學總醫院
• 主分類號: G01Q60/44
• 分類號: G01Q60/44
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明涉及一種血小板形態掃描成像和血小板活化功能評估的方法。

背景技術

血小板是血液中具有特定的形態結構和生化組成的有形成分之一,其主要生理功能是參與凝血與止血。血小板結構復雜且個體差異較大，因能運動和變形，往往表現為多形態。循環血液中正常狀態的血小板呈橢圓形或圓盤形，平均直徑約2～4微米。血小板易受機械、化學刺激而活化并導致形態改變。當血小板一旦與創傷面或激活劑接觸，可擴展成為圓片狀血小板，以增加凝血與止血的面積。凝血酶、ADP、腎上腺素和膠原等都是血小板的激活劑。任何凝血與止血過程也都涉及血小板的活化，因此通過體外實時檢測激活劑作用下血小板形態的變化，即可直觀評估血小板的生理功能。目前用于檢測血小板形態的方法和儀器種類較多，其中普通光學顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡的分辨率僅能達到200納米左右，不能滿足血小板微觀形貌高分辨率觀測的需要。掃描電鏡（SEM）盡管具有足夠高的分辨率，但需要對血小板進行固化和特別處理以實現樣品的導電性，這勢必會改變、甚至破壞血小板表面的微觀結構，因此根本不適合活體血小板的觀測。而掃描探針顯微鏡家族中作為高分辨率生物成像研究有力工具的原子力顯微鏡（AFM），已被用于血小板微形貌的三維拓撲結構研究，但由于其利用探針針尖與血小板膜間的相互作用力進行負反饋控制以實現掃描成像，掃描中探針與活體血小板的輕微接觸不可避免，不僅會損傷血小板的表面結構，其機械作用力也可激活血小板引起形態變化，因此也不能滿足血小板激活劑作用前后微形貌成像的需要。

為了克服原子力顯微鏡需要掃描探針與樣品接觸而損傷或激活生物樣品的缺點，加州大學的Hansma教授于1989年發明了非接觸式的掃描離子電導顯微鏡技術(scanning?ion?conductance?microscopy,SICM)，由于當時負反饋控制方法及精確定位技術的局限與不足，纖細的玻璃微滴管探針在掃描時經常意外地與樣品接觸并導致針尖或樣品損壞，SICM技術在其發明后的很長一段時間僅適用于平坦的聚酯薄膜掃描成像。近年來SICM技術通過改進定位及掃描控制技術實現了在生理液態培養條件下實時、非接觸式地對活體生物樣品表面三維微觀結構的探測。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種血小板形態掃描成像的方法。

本發明的第二個目的是提供一種血小板活化功能評估方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種血小板形態掃描成像的方法，包括如下步驟：

（1）血小板樣品的制備

取2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，離心后得到富血小板血漿；取200μL所述富血小板血漿放置于涂覆有200μL濃度為2mg/mL的纖維蛋白原的35mm細胞培養皿中室溫下孵育20-30分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細胞培養皿底部的血小板后，加入1.5-2mLPBS緩沖液后備用；

（2）將連接在掃描離子電導顯微鏡的Ag/AgCl參比電極放置在步驟（1）獲得的細胞培養皿中；將連接在掃描離子電導顯微鏡的探測電極放置在步驟（1）獲得的細胞培養皿中，所述探測電極是一設置在充灌有PBS緩沖液的納米吸管內的Ag/AgCl電極；

（3）用掃描離子電導顯微鏡監控流入探測電極電流的變化，通過負反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設定的距離，記錄下所述探測電極的位置，通過計算機繪制得到血小板表面形貌的三維拓撲結構圖。

一種血小板活化功能評估方法，包括如下步驟：

（1）血小板樣品的制備

取2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，離心后得到富血小板血漿；取200μL所述富血小板血漿放置于涂覆有200μL濃度為2mg/mL纖維蛋白原的35mm細胞培養皿中室溫下孵育20-30分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細胞培養皿底部的血小板后，加入1.5-2mLPBS緩沖液后備用；

（2）將連接在掃描離子電導顯微鏡的Ag/AgCl參比電極放置在步驟（1）獲得的細胞培養皿中；將連接在掃描離子電導顯微鏡的探測電極放置在步驟（1）獲得的細胞培養皿中，所述探測電極是一設置在充灌有PBS緩沖液的納米吸管內的Ag/AgCl電極；

（3）用掃描離子電導顯微鏡監控流入探測電極電流的變化，通過負反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設定的距離，記錄下所述探測電極的位置，通過計算機繪制得到血小板表面形貌的三維拓撲結構圖；

（4）再向細胞培養皿中加入激活劑，作用10-20分鐘，通過計算機繪制得到加入所述激活劑10-20分鐘血小板表面形貌的三維拓撲結構圖。