[發明專利]嗜熱長鏈烷醛醛脫氫酶及其晶體結構

有效

• 申請號: 201210156846.5
• 申請日: 2012-05-18
• 公開（公告）號: CN102676464A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 馬克·巴特蘭姆;王瑩瑩;紀玉蕊;郝振宇;毛冠男
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/70;G01N23/20;C12R1/01
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

1.一種嗜熱脫氮芽孢桿菌內的嗜熱長鏈烷醛醛脫氫酶，其特征在于該嗜熱長鏈烷醛醛脫氫酶的晶體結構如下：分辨率為晶體的空間群為C2221，晶體為四聚體，在每個不對稱單元中含有兩個分子。在A鏈中能夠看見1-477個殘基，在B鏈中能夠看到6-477個殘基；每個亞單位含有24個β片層和13個α螺旋；該單體的結構含有一個特征性的ALDH折疊，由三個結構域構成：一個輔酶結合域，包括殘基1-119,141-247和439-462，構成一個羅斯曼折疊，用于結合輔酶NAD⁺；一個催化域，包括殘基248-43；一個寡聚化域，包括殘基120-140和463-477，用于二聚化。

2.根據權利要求1所述的嗜熱長鏈烷醛醛脫氫酶，其特征在于所述的醛脫氫酶的活性中心結構特征為：三個結構域的交界面處構成一個長度為的漏斗形的通道，該通道有一個的開口通向催化口袋；該通道的核心部分排列著疏水殘基，這些疏水殘基允許底物進入催化部位；起催化作用的殘基Cys281位于底物結合通道的最底部，這個殘基具有極性，這樣可以滿足去質子化、親核攻擊并形成一個氧離子的催化需求；輔酶NAD⁺的結合位點處于一個由羅斯曼折疊形成的伸長的口袋狀的輔酶結合域，該輔酶結合域處在催化域的對面。

3.一種權利要求1所述的嗜熱長鏈烷醛醛脫氫酶的晶體結構的確定方法，其特征在于經如下步驟得到：

a.利用酚抽提法從嗜熱脫氮芽孢桿菌（Geobacillus?thermodenitrifcans）NG80-2菌體中提取其基因組DNA；利用聚合酶鏈式反應PCR擴增該嗜熱長鏈烷醛醛脫氫酶基因，利用分子生物學方法將該基因克隆到大腸桿菌E.coli中；

b.將含有該嗜熱長鏈烷醛醛脫氫酶基因的重組質粒的大腸桿菌E.coli的菌液，載體為pET-28a(+)，接種到5ml經過滅菌且添加100mg/l?kanamycin抗生素的LB液體培養基中，在37℃搖床中過夜培養12個小時后，轉到1L經過滅菌且添加100mg/l?kanamycin抗生素的LB液體培養基中，在37℃搖床中培養5-6個小時后，利用終濃度為0.1mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進行目的蛋白質的誘導表達，45℃下誘導2.5個小時后利用離心機收集菌體，收集到的菌體在pH8.0的緩沖液50mM?Tris-HCl,300mM?NaCl中重新溶解；

c.利用超聲波破碎步驟b中得到的菌體的細胞壁并利用高速離心機進行離心，離心后的上清液利用鎳離子金屬螯合親和層析柱進行初步純化，洗脫下的蛋白質濃縮后利用AKTA蛋白質純化儀的陰離子交換柱Resource?Q和分子篩凝膠色譜柱Superdex20010/300GL進行純化，得到電泳純的蛋白酶；

d.將電泳純蛋白酶樣品通過懸滴氣相擴散法進行結晶，得到適宜X射線衍射的醛脫氫酶的蛋白質晶體；

e.利用X射線衍射法對步驟d中得到的醛脫氫酶的蛋白質晶體進行數據收集，在收集到醛脫氫酶的X射線衍射數據后，首先使用HKL2000對收集得到的衍射數據進行處理，獲得完整的數據文件；再使用CCP4程序包中的Phaser軟件，利用分子置換（MR，Molecular?Replacement）方法得到如權利要求1所述的嗜熱脫氮芽孢桿菌中的醛脫氫酶的三維結構；

f.通過對步驟e中得到的結構進行分析，對其活性部位的保守殘基進行定點突變，利用重疊延伸法得到保守位點突變的該醛脫氫酶基因，利用a中的步驟得到突變體菌株，并利用b、c中的步驟進行突變體蛋白的純化，得到電泳純蛋白之后將c中得到的蛋白和本步驟中得到的突變體蛋白同時進行酶活性測定，測定結果顯示突變體蛋白沒有酶活性，顯示出突變位點殘基對于酶功能的發揮具有重要作用。